示出卡方測(cè)試，該測(cè)試提供賦予熱帶銹病抗性的單個(gè)顯性基因存在的證據(jù)， 其中在PHS6Y自交體中存在有利基因型。結(jié)果也顯示單個(gè)顯性基因賦予南方銹病抗性。然 而，基于兩個(gè)F2種群（其中PHS6Y是親本）中熱帶銹病和南方銹病抗性間的基因重組頻率， 熱帶銹病和南方銹病賦予抗性的基因似乎是不同的（表6)。
[0308]表 5:
[0309] PH468xPHS6Y F2種群的卡方測(cè)試結(jié)果
[0310]
[0311] 表6示出具有PHS6Y的兩個(gè)F2種群中的熱帶銹病和南方銹病抗性間的基因重組 頻率。對(duì)照物是另一個(gè)F2種群，其中熱帶銹病和南方銹病性狀也是分離的，但是以一種獨(dú) 立的方式分離。
[0312]表 6:
[0313] 具有作為親本的PHS6Y的兩個(gè)F2種群中的熱帶銹病和南方銹病抗件間的基_重 M
[0314]
[0315] 468 = PH468 ；S6Y = PHS6Y ；467 = PH467
[0316] 實(shí)施例4
[0317] 混合岡間作圖
[0318] 使用將區(qū)間作圖與線性回歸相結(jié)合的混合區(qū)間作圖方法鑒定玉米染色體區(qū)間和 與熱帶銹病抗性相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。在區(qū)間作圖方法中（Lander和Botstein，Genetics 121: 185-199(1989))，測(cè)試沿基因圖譜（lcM的區(qū)間）的許多位點(diǎn)中的每一個(gè)位點(diǎn)上基因或控制 受關(guān)注性狀的QTL位于該位點(diǎn)的概率?；蛐?表型數(shù)據(jù)用于計(jì)算每個(gè)測(cè)試位點(diǎn)的L0D評(píng) 分（概率比率的對(duì)數(shù)）。當(dāng)L0D評(píng)分大于閾值（本文閾值為2. 5)時(shí)，存在基因或QTL位點(diǎn) 位于基因圖譜上的該位點(diǎn)上的顯著證據(jù)（它將位于兩個(gè)特定標(biāo)記基因座之間）。
[0319] 使用Windows QTL Cartographer (該軟件的最新版本被用于QTL作圖）進(jìn)行混合 區(qū)間作圖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)QTL作圖程序預(yù)測(cè)基因組的L0D評(píng)分（優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)比率）。
[0320] 圖3示出使用PH468x PHS6Y F2種群的熱帶銹病抗性的混合區(qū)間作圖結(jié)果?；旌?區(qū)間作圖分析檢測(cè)位于C00441-801和C00428-801標(biāo)記之間的染色體10(圖3)上的強(qiáng)效 應(yīng)QTL。用于混合區(qū)間作圖的連鎖圖譜是內(nèi)源的專有基因圖譜（本文稱為"PHB")，其基因 距離對(duì)應(yīng)于單個(gè)減數(shù)分裂的重組部分。在X軸上的標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于PHB基因圖譜。y軸代 表LOD評(píng)分。
[0321] 實(shí)施例5
[0322] 來(lái)自PHS6Y的熱帶銹病抗件基閔座回奪到易感自?shī)Z系中
[0323] 選擇熱帶銹病抗性自交系PHS6Y作為回交程序的供體親本。這個(gè)自交系在包含熱 帶銹病基因的染色體10片段內(nèi)攜帶有利的等位基因。在初始回交程序中，選擇四個(gè)自交系 (PH9VF、PHDGA、PH467和PH0TJ)用來(lái)自PHS6Y的熱帶銹病抗性基因座轉(zhuǎn)化。
[0324] 每個(gè)自交系（PH9VF、PHDGA、PH467和PH0TJ)均與PHS6Y雜交。在獲得每個(gè)雜交 的F1種子后，隨后進(jìn)行五次回交，其中易感的親本用作輪回親本。評(píng)價(jià)一年兩代以加速 該過(guò)程，一個(gè)位于巴西北方的Balsas Winter Nursery，另一個(gè)位于Itumbiara Research Center。在第一次回交中，僅僅在Itumbiara中心進(jìn)行表型選擇。在隨后的回交中，進(jìn)行標(biāo) 記輔助選擇。回交過(guò)程后進(jìn)行兩代自交以固定每個(gè)自交體中的抗性等位基因。
[0325] 在轉(zhuǎn)化每個(gè)自交體的過(guò)程中使用三個(gè)至六個(gè)標(biāo)記（表7)。所述標(biāo)記在回交2(BC2) 代至BC4代中使用，以及用于鑒定BC4F2上攜帶抗性等位基因的純合植株。
[0326] 表7示出用于將來(lái)自PHS6Y的抗性基因座滲入自交體PH9VF、PHDGA、PH467和 PH)TJ的染色體10上的標(biāo)記，以及各個(gè)易感自交體和PHS6Y之間的多態(tài)性。
[0327] 轉(zhuǎn)化其它自交體以具有來(lái)自PHS6Y的熱帶銹病抗性基因座。如上所述進(jìn)行相似的 轉(zhuǎn)化，不同的是轉(zhuǎn)化使用較多的標(biāo)記。表8示出用于將來(lái)自PHS6Y的抗性基因座滲入18個(gè) 自交體的染色體10上的標(biāo)記以及各個(gè)易感自交體和PHS6Y之間的多態(tài)性。
[0328]表 7:
[0329] 用于四個(gè)自?shī)Z體轉(zhuǎn)化的染色體10標(biāo)iP,
[0330]
[0331] 1 ="A"，2 ="C"，3 ="G"，4 = "T"，5 ="1" 或插入，6 ="D" 或缺失
[0332]表 8:
[0333] 用于八個(gè)自?shī)Z體轉(zhuǎn)化的染色體10標(biāo)iP,
[0334]


[0338] l ="A"，2 ="C"，3 ="G"，4 = "T"，5 ='T，或插入，6 ="D" 或缺失
[0339] 實(shí)施例6
[0340] 制備具有增強(qiáng)的熱帶銹病抗件的雜奪體
[0341] 轉(zhuǎn)化過(guò)的自交體用于制備雜交體，并且田間試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)顯示在轉(zhuǎn)化過(guò)的自交體 中具有優(yōu)異水平的抗性（例如圖4)，該水平在用轉(zhuǎn)化自交體制備的雜交體中保持（圖5 ;例 如雜交 GEID6170295)。
[0342] 實(shí)施例7
[0343] 基_分銦具有熱帶銹病抗件的玉米品系并鑒宙與增強(qiáng)熱帶銹病抗件相關(guān)聯(lián)的多 杰件
[0344] 基_分銦具有熱帶銹病抗件的玉米品系
[0345] 通過(guò)目標(biāo)基因組的Sanger再測(cè)序基因分型抗性品系和易感品系。所述目標(biāo)是來(lái) 自熱帶銹病QTL區(qū)域的單拷貝基因組片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述QTL區(qū)域在圖譜上位于染 色體10的短臂上。
[0346] 公開(kāi)可用的基因組序列用作引物設(shè)計(jì)的參考。公開(kāi)序列對(duì)應(yīng)于自交系B73并通 過(guò)BAC最少覆蓋途徑方法（在Maize Genome Browser上可用，它在因特網(wǎng)上是公開(kāi)可用 的）。以下定位BAC的克隆已經(jīng)對(duì)受關(guān)注的區(qū)域作圖：C0497112、c0284b01、C0446110、 c0340ml4、 c0178k23、 c0332el0、 c0009kll、 c0281ell、 c0230k24、 b0286cl2、 c0044b04、 c0149n21、c0064gll、c0118o03、b0191e02、c0462j05。而在覆蓋途徑中的 BAC 的順序 和取向已經(jīng)通過(guò)指紋法進(jìn)行測(cè)定（Nelson等人，2005. Whole-Genome Validation of High-Information-Content Fingerprinting. Plant Physiology. 139 :27_38)，在每個(gè)克 隆內(nèi)的序列重疊群的順序和取向尚未被完全測(cè)定。對(duì)于這個(gè)工作，使用BAC重疊的內(nèi)部信 息進(jìn)一步將2-2. 5Mb區(qū)域的序列順序縮小至24個(gè)子區(qū)域（圖6)。
[0347] 所述序列包括大部分高度重復(fù)的DNA，大多數(shù)是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子樣序列。使用 Cross-match (http ://www. phrap. org)，通過(guò)遮蔽重復(fù)序列從該序列中鑒定并移除多拷貝 序列路徑。通過(guò)BLAST分析進(jìn)一步鑒定并移除低拷貝序列。
[0348] PCR引物初始設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增在單拷貝路徑的270-720-bp的擴(kuò)增子，所述路徑 跨越染色體10目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的24個(gè)子區(qū)域（表9)。使用專有工具基于PrimerfOtozen， S?和Skaletsky，2000，Primer3 on the WWW for general users and forbiologist programmers，Methods Mol Biol. 132 :365_386.)設(shè)計(jì)引物組。分別將測(cè)序引物 M13R(5-GGAAACAGCTATGACCATG)和M13F(5-TGTAAAACGACGGCCAGT)加到L和R引物上作為 尾部以利于測(cè)序。PCR測(cè)定的質(zhì)量和唯一性通過(guò)進(jìn)行并分析預(yù)備PCR以及對(duì)來(lái)自品系B73 和M〇17的對(duì)照DNA樣品的測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。玉米-燕麥添加品系擴(kuò)增用于進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)定。 棄去在多個(gè)添加品系中產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物或僅在染色體10玉米-燕麥添加品系中不產(chǎn)生擴(kuò)增 產(chǎn)物的PCR引物。
[0349]表 9:
[0350] 設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增染色體10目標(biāo)岡域中的產(chǎn)物的PCR引物
[0351]
[0352] 使用 HotStar Taq Polymerase Master Mix (Qiagen)，根據(jù)制造商的推薦，采用一 些修改對(duì)10_30ng DNA進(jìn)行PCR?？偡磻?yīng)體積為10yl并且包含5U HotStar Taq DNA聚合 酶，1. 5mM MgC12,200 yM dNTP和5pM各種加尾引物。如下進(jìn)行PCR擴(kuò)增：1)在95°C下進(jìn)行 15-分鐘的初始步驟；2)40個(gè)如下循環(huán)：95 1€30秒，601€30秒，72°(：下1分鐘；以及3)在 72°C下進(jìn)行10分鐘的最終延伸步驟。通過(guò)凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的五分之 一（2 y 1)在 17 y 1 無(wú)菌蒸餾水中稀釋并用 0? 5-0. 75 y 1 ExoSAP-IT (USB Corporation)清 潔，在37°C下孵育25分鐘，然后在80°C下孵育25分鐘。
[0353] PCR擴(kuò)增子的雙向循環(huán)測(cè)序使用Big Dye Terminator循環(huán)測(cè)序規(guī)程進(jìn)行，并且毛 細(xì)管測(cè)序在Applied Biosystems 3730 XL DNA分析儀中進(jìn)行。3-5 yl清潔DNA使用M13F 和M13R寡核苷酸和BigDye Prism測(cè)序試劑盒（ABI ;version 3. 1)，根據(jù)制造商的條件進(jìn) 行測(cè)序。在測(cè)序循環(huán)后，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)乙醇沉淀進(jìn)行清潔并在ABI3730xl自動(dòng)測(cè)序儀（ABI) 上根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行處理。
[0354] 使用基于Phrap，Phred軟件的內(nèi)部工具裝配序列（Ewing等人，1998，Basecalling of automated sequencer traces using phred. I.Accuracy assessment. Genome Research. 8 ：175-185 ；Ewing and Green，1998，Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 :186-194)〇 使用 Consed sequence viewer鑒定并標(biāo)記多態(tài)性（單核苷酸和插入-缺失）（Gordon，2003， Viewing and Editing Assembled Sequences Using Consed, in Current Protocols in Bioinformatics，A. D.Baxevanis 和 D.B. Davison (eds)，New York: John Wiley&Co.，2004， 11. 2. 1-11. 2. 43)。生成的SNP表、裝配組和共有序列用于選擇合適的多態(tài)性以開(kāi)發(fā)標(biāo)記。
[0355] 鑒宙與增強(qiáng)的熱帶銹病抗件相關(guān)聯(lián)的多杰件
[0356] 具有高水平的內(nèi)部多樣性的DNA片段比較可能包含受關(guān)注的基因。然而，在這些 區(qū)域中設(shè)計(jì)引物可能是困難的，因?yàn)橐镌O(shè)計(jì)應(yīng)用具有選擇隨機(jī)變異用于引物設(shè)計(jì)的趨 勢(shì)。測(cè)試多階段集群方法以指導(dǎo)非隨機(jī)變異的引物設(shè)計(jì)。這種方法使用系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和連 續(xù)比對(duì)方法以鑒定包含具有增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的品系獨(dú)有的等位基因變異的獨(dú)特區(qū)域。 這個(gè)方法的第一階段涉及比對(duì)開(kāi)放：延伸代價(jià)比大于10的原始序列。第二階段包括修剪 尾部（噪音）。隨后的階段由隨機(jī)等位基因變異的修剪組成，即，序列內(nèi)的等位基因顯示跨 任何表型的多樣性。然后可將UPGMA(非加權(quán)配對(duì)組算數(shù)平均法，Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)應(yīng)用于所得比對(duì)直至表型關(guān)系圖鑒定抗性品系獨(dú)有的集 群。
[0357] 一個(gè)引物對(duì)（SEQ ID NO : 133和SEQ ID NO : 134)產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)增子，其具有參考序 列（3￡〇10勵(lì)：155)，該序列本文稱為？腿了1?。顯示熱帶銹病抗性的全部品系包含？腿了1?的 16bp T-缺失（PHMTR-T區(qū)域的序列是SEQ ID N0:156)，而全部易感熱帶銹病的玉米品系 包含完整的PHMTR區(qū)域（SEQ ID N0 :155)。
[0358] 圖7示出通過(guò)對(duì)熱帶銹病抗性的和易感的玉米品系的基因分型獲得的部分參考 序列（頂部），所述基因分型使用設(shè)計(jì)用于克隆ID Ct9050c064Gllc的PCR引物（SEQ ID N0:133和134)(表9)。SEQ ID N0:137-142示出獲取自抗性品系的擴(kuò)增子，而SEQ ID NO: 143-154示出獲取自易感品系的擴(kuò)增子。用灰色突出顯示的區(qū)域示出參考序列（SEQ ID NO: 155)的21bp區(qū)域。
[0359] 擴(kuò)增子序列也使用引物 SEQ ID NO : 135 和 SEQ ID NO : 136 (SEQ ID NO : 167 是這 個(gè)區(qū)域的參考系列）以及八個(gè)獨(dú)立的集獲得。表10示出評(píng)價(jià)集分析的21個(gè)品系。發(fā)現(xiàn) GAG單倍型（參考序列SEQ ID N0 :167的位點(diǎn)337-339上；參見(jiàn)圖8)是全部具有增強(qiáng)熱帶 銹病抗性的品系獨(dú)有的（表10和圖8)。開(kāi)發(fā)兩個(gè)新的存在/缺失標(biāo)記，使用kbioscience 網(wǎng)站上所述的KASPar測(cè)定技術(shù)測(cè)定這個(gè)單倍型，所述存在/缺失標(biāo)記是C06621-1-K2和 C06621-1-K4(表 3;SEQ ID N0:157-164)。C06621-1-K2 和 C06621-1-K4 是 X/P 型標(biāo)記，其 中X指示缺失而P指示存在。P標(biāo)記檢測(cè)GAG多態(tài)性而X標(biāo)記檢測(cè)ADH (-個(gè)內(nèi)部對(duì)照基 因，它用于顯示反應(yīng)進(jìn)行）。用C06621-1-K2和C06621-1-K4標(biāo)記評(píng)價(jià)十八個(gè)品系。進(jìn)行集 分析的全部品系符合兩個(gè)標(biāo)記的期望（除了一個(gè)具有缺失數(shù)據(jù)的樣品外）。
[0360]表 10:
[0361] 具有增強(qiáng)熱帶銹病抗件的品系中的專用單倍銦
[0362]
[0363] 多階段集群方法證明是用于鑒定包含具有增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的品系獨(dú)有的等 位基因變異的獨(dú)特區(qū)域的有效方法，并且這個(gè)方法可應(yīng)用于受關(guān)注的任何性狀。
[0364] 實(shí)施例8
[0365] 在標(biāo)iP,輔助詵擇具有增強(qiáng)熱帶銹病抗件的玉米棺株中伸用的標(biāo)iP,和/或單倍銦
[0366] 一組常見(jiàn)標(biāo)記可用于輔助可用于選擇具有增強(qiáng)熱帶銹病抗性的玉米植株的其它 標(biāo)記的鑒定。表11顯示本文鑒定的標(biāo)記，所述標(biāo)記限定包含賦予熱帶銹病抗性的基因的區(qū) 間。標(biāo)記在物理圖譜順序上（如圖1所示）。也顯示了在PHB內(nèi)部來(lái)源的圖譜（基于單一 減數(shù)分裂）和IBM2neighb 〇rs基因圖譜（高分辨率B73/M〇17基因圖譜）上的標(biāo)記位點(diǎn)。
[0367]表 11:
[0368] PHB圖譜和IBM2Neighbors圖譜h的分子標(biāo)iP,位點(diǎn)
[0369]
[0370] na=不適用
[0371] 側(cè)接受關(guān)注基因座的緊密連鎖標(biāo)記可有效地用于選擇具有增強(qiáng)的熱帶銹病抗性 的子代植株，所述基因座具有與在該基因座處的抗性等位基因連鎖不平衡的等位基因。因 此，本文所述的標(biāo)記如表11中列出的那些、以及與相同染色體片段基因上或物理上連鎖的 其它標(biāo)記可用于選擇具有增強(qiáng)熱帶銹病抗性的玉米植株。通常將使用在基因上的側(cè)接區(qū)域 中的一組這些標(biāo)記（例如2個(gè)或更多個(gè)，3個(gè)或更多個(gè)，4個(gè)或更多個(gè)，5個(gè)或更多個(gè)）并在 基因下的側(cè)接區(qū)域中使用相似的一組標(biāo)記。任選地也可使用在實(shí)際基因和/或基因座內(nèi) 的標(biāo)記。篩選親本和它們的子代的這些標(biāo)記組，并且兩個(gè)親本間的多態(tài)性標(biāo)記被用于選擇。 最接近基因或基因座的多態(tài)性標(biāo)記用于選擇基因或基因座，并且較遠(yuǎn)端的多態(tài)性標(biāo)記用于 反選基因或基因座。在一個(gè)滲入程序中，這允許選擇在較接近多態(tài)性標(biāo)記上的基因或基因 座基因型以及選擇在較遠(yuǎn)端多態(tài)性標(biāo)記上的輪回親本基因型。
[0372] 單倍型或等位基因的組合也可用于選擇育種程序中的植株。單倍型可提供比單個(gè) 多態(tài)性更多的信息并且可更多地描述任何特定基因型。一旦一個(gè)獨(dú)特的單倍型已經(jīng)被轉(zhuǎn)讓 給供體的染色體區(qū)域，例如在染色體10的短臂上的PHS6Y的單倍型，該單倍型可在那個(gè)種 群或其任何亞群中使用以測(cè)定個(gè)體是否具有特定基因。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的自 動(dòng)化高通量標(biāo)記檢測(cè)平臺(tái)使得這種方法高度有效率并有效。本文公開(kāi)的標(biāo)記等位基因可單 獨(dú)地或組合地使用以通過(guò)使用標(biāo)記輔助選擇來(lái)選擇具有增強(qiáng)熱帶銹病抗性的植株。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 選擇具有增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，包括： a. 在所述玉米植株中檢測(cè)第一標(biāo)記等位基因，所述第一標(biāo)記等位基因與以下序列連鎖 并關(guān)耳關(guān)： 參考序列SEQ ID NO: 167的位置337-339處的"GAG"單倍型；以及 b.選擇具有所述第一標(biāo)記等位基因的所述玉米植株。2. 權(quán)利要求1的方法，其中在單一減數(shù)分裂圖譜上，所述第一標(biāo)記等位基因與參考序 列SEQIDNO:167的位置337-339處的"GAG"單倍型連鎖20cM。3. 權(quán)利要求1的方法，其中在單一減數(shù)分裂圖譜上，所述第一標(biāo)記等位基因與參考序 列SEQIDNO:167的位置337-339處的"GAG"單倍型連鎖2cM。4. 選擇具有增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，包括： a.在所述玉米植株中檢測(cè)參考序列SEQ ID NO: 167的位置337-339處的"GAG"單倍 型；以及 b.選擇具有參考序列SEQ ID NO: 167的位置337-339處的"GAG"單倍型的所述玉米植 株。5. 選擇顯示增強(qiáng)的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括： a.獲取第一玉米植株，所述第一玉米植株的基因組內(nèi)包含參考序列SEQ ID NO: 167的 位置337-339處的"GAG"； b.將所述第一玉米植株與第二玉米植株雜交； c.對(duì)子代植株進(jìn)行參考序列SEQ ID NO: 167的位置337-339處的"GAG"的評(píng)價(jià)；以及 d.選擇具有參考序列SEQ ID NO: 167的位置337-339處的"GAG"的子代植株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及與玉米熱帶銹病(玉米殼銹菌)抗性相關(guān)聯(lián)的基因座，用于鑒定具有提高的或降低的熱帶銹病抗性的玉米植株的方法和組合物。所述方法使用分子標(biāo)記以鑒定并選擇具有提高的熱帶銹病抗性的植株或鑒定并反選具有降低的熱帶銹病抗性的植株。通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的玉米植株也是本發(fā)明的一個(gè)特征。用于關(guān)聯(lián)等位基因變異與受關(guān)注性狀的方法也是受關(guān)注的。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105063195
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510468521
【發(fā)明人】S.C.K.米拉赫, V.拉卡, M.G.布特勒伊勒, E.林伯格, E.D.O.阿爾貝斯
【申請(qǐng)人】納幕爾杜邦公司, 先鋒國(guó)際良種公司
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2010年11月3日
【公告號(hào)】CA2778828A1, CN103108541A, CN103108541B, EP2496072A2, US8809623, US20110107453, WO2011056836A2, WO2011056836A3