推。
[0139] 如本文所用，術語"連鎖"用于描述一個標記基因座與另一個標記基因座或一些其 它基因座（例如熱帶銹病基因座）相關聯(lián)的程度。分子標記和表型（例如增強的熱帶銹病 抗性）之間的連鎖關系用"概率"或"調(diào)整概率"表示。連鎖可以用期望的限度或范圍表達。 例如在一些實施方案中，當標記分離距離為小于50、40、30、25、20、或15圖譜單位（或〇]?) 時，任何標記與任何其它標記連鎖（基因上和物理上）。在一些方面，限定加括號的連鎖范 圍是有利的，例如介于10cM和20cM之間，介于10cM和30cM之間，或者介于10cM和40cM之 間。標記與第二基因座的連鎖越緊密，標記對第二基因座的指示效果越好。因此，"緊密連鎖 的基因座"如標記基因座和第二基因座顯示10%或更低，優(yōu)選約9%或更低，更優(yōu)選約8% 或更低，更優(yōu)選約7 %或更低，更優(yōu)選約6 %或更低，更優(yōu)選約5 %或更低，更優(yōu)選約4 %或更 低，更優(yōu)選約3%或更低，更優(yōu)選約2%或更低的基因座內(nèi)重組頻率。在高度優(yōu)選的實施方 案中，關聯(lián)基因座顯示約1 %或更低的重組頻率，例如約〇. 75%或更低，更優(yōu)選約0. 5%或 更低，更優(yōu)選約〇. 25%或更低的重組頻率。位于相同染色體上，并且它們間的距離使得兩 個基因座間的重組發(fā)生頻率小于10% (例如約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、 0. 75%、0. 5%、0. 25%、或更低）的兩個基因座也稱為彼此"接近"。因為一 cM是顯示出1% 的重組頻率的兩個標記之間的距離，任何標記與接近的任何其它標記緊密連鎖（基因上和 物理上），例如等于或小于10cM的距離。相同染色體上的兩個緊密連鎖的標記可被彼此定 位于 9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25〇]?或更小。
[0140] 術語"連鎖不平衡"指基因座或性狀（或者兩者都有）非隨機地分離。在任一情 況下，連鎖不平衡意味著相關的基因座沿著一段染色體在物理上足夠接近，以便它們以大 于隨機（即非隨機）的頻率一起分離（在共分離性狀的情況下，產(chǎn)生該性狀的基因座彼此 足夠接近）。顯示連鎖不平衡的標記被認為是連鎖的。連鎖基因座在超過50 %的情況下共 分離，例如約51%至約100%的情況。換句話說，共分離的兩個標記具有小于50% (并且 根據(jù)定義，在相同連鎖群上分離距離小于50cM)的重組頻率。如本文所用，連鎖可存在于兩 個標記或者標記和表型之間。標記基因座可與性狀"相關聯(lián)"（連鎖），例如對熱帶銹病的 抗性。測量分子標記與表型性狀的連鎖程度，例如分子標記與表型共分尚的統(tǒng)計學概率。
[0141] 連鎖不平衡最常見地用量度r2測量，它通過Hill，W.G?和Robertson，A，Theor. Appl. Genet. 38 :226-231 (1968)。當r2= 1時，兩個標記基因座間存在完全的LD，意味著標 記還未進行重組分離并且具有相同的等位基因頻率。r2值大于1/3指示足夠強的LD將被 用于作圖（Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3 :299_309(2002))。因此，當成對標記 基因座間的r2值大于或等于0. 33、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、或1. 0時，等位基因處于連 鎖不平衡。
[0142] 如本文所用，"連鎖平衡"描述其中兩個標記獨立地分離的情況，即，在子代中隨機 分離。認為顯示連鎖平衡的標記不連鎖（無論它們是否位于相同染色體上）。
[0143] "基因座"是基因或標記位于染色體上的位點。
[0144] "優(yōu)勢對數(shù)（L0D)值"或 "L0D 評分"（Risch，Science 255 :803-804 (1992))用于 區(qū)間作圖以描述兩個標記基因座之間的連鎖程度。兩個標記間L0D評分為三指示連鎖概率 比無連鎖的概率高1000倍，而L0D評分為二指示連鎖概率比無連鎖的概率高100倍。大于 或等于二的L0D評分可用于檢測連鎖。
[0145] "玉米"指玉米屬（Zea mays L. ssp. mays)植株，也稱為玉蜀黍。
[0146] 術語"玉米植株"包括：整個玉米植株、玉米植株細胞、玉米植株原生質(zhì)體、可從其 中再生玉米植株的玉米植株細胞或玉米組織培養(yǎng)物、玉米植株愈傷組織和玉米植株中的完 整玉米植株細胞或玉米植株部分，如玉米種子、玉米芯、玉米花、玉米子葉、玉米葉、玉米莖、 玉米芽、玉米根、玉米根尖等。
[0147] "標記"是用作參考點的核苷酸序列或其編碼產(chǎn)物（例如蛋白）。標記能夠來源于 基因組核苷酸序列或表達的核苷酸序列（例如來源于剪接的RNA或cDNA)，或來源于編碼 的多肽。該術語也指與標記序列互補或側(cè)接標記序列的核酸序列，如用作探針或能夠擴增 標記序列的引物對的核酸。
[0148] 對應于種群成員之間的遺傳多態(tài)性的標記能夠通過本領域已建立的方法進行檢 測。這些方法包括例如DNA測序、基于PCR的序列特異性擴增方法、限制性片段長度多態(tài)性 檢測（RFLP)、同功酶標記檢測、通過等位基因特異性雜交（ASH)進行的多核苷酸多態(tài)性檢 測、植株基因組的擴增可變序列檢測、自主序列復制檢測、簡單重復序列檢測（SSR)、單核苷 酸多態(tài)性檢測（SNP)、或擴增片段長度多態(tài)性檢測（AFLP)。已經(jīng)建立的方法也已知用于檢 測表達序列標簽（EST)和來源于EST序列的SSR標記以及隨機擴增的多態(tài)性DNA(RAPD)。
[0149] "標記等位基因"或者"標記基因座的等位基因"可以指種群中位于標記基因座的 多個多態(tài)性核苷酸序列的其中一個，它就標記基因座而言是多態(tài)的。
[0150] "標記輔助選擇"（MAS)是基于標記基因型選擇個體植株的方法。
[0151] "標記輔助反選"是一種通過它將標記基因型用于鑒定植株的方法，所述植株將不 被選擇，使得它們被從育種程序或種植中除去。
[0152] "標記基因座"是物種基因組中的特定染色體位點，其中可存在特定標記。"標記基 因座"可用于追蹤存在的第二連接基因座，例如編碼或有助于表達表型性狀的連接的基因 座。例如標記基因座能夠用于監(jiān)控等位基因在某一基因座的分離，如基因或QTL，它們與標 記基因座在遺傳上或在物理上連鎖。
[0153] "標記探針"是可用于通過核酸雜交鑒定標記基因座存在與否的核酸序列或分子， 例如與標記基因座序列互補的核酸分子探針。包含標記基因座的30個或更多連續(xù)的核苷 酸（"全部或部分"標記基因座序列）的標記探針可用于核酸雜交。作為另外一種選擇，在 某些方面標記探針指能夠區(qū)別（即基因型）存在于標記基因座上的特定等位基因的任何類 型的探針。當核酸在溶液中特異性"雜交"或配對時，例如根據(jù)Watson-Crick堿基配對原 則雜交，核酸是"互補的"。
[0154] 如上所述，當鑒定連鎖基因座時，術語"分子標記"可用于指遺傳標記，或其用作參 照點的編碼產(chǎn)物（例如，蛋白質(zhì)）。標記能夠來源于基因組核苷酸序列或表達的核苷酸序 列（例如來源于剪接的RNA、cDNA等），或來源于編碼的多肽。該術語也指與標記序列互補 或側(cè)接標記序列的核酸序列，如用作探針或能夠擴增標記序列的引物對的核酸。"分子標記 探針"是可用于通過核酸雜交鑒定標記基因座存在與否的核酸序列或分子，例如與標記基 因座序列互補的核酸分子探針。作為另外一種選擇，在某些方面分子探針指能夠區(qū)別（即 基因型）存在于標記基因座上的特定等位基因的任何類型的探針。當核酸在溶液中特異性 "雜交"時，例如根據(jù)Watson-Crick堿基配對原則雜交，核酸是"互補的"。本文所述的一些 標記當位于插入缺失區(qū)域例如本文所述的非共線區(qū)域時也稱為雜交標記。這是因為插入?yún)^(qū) 域根據(jù)定義是相對無插入序列的植株的多態(tài)性。因此，所述標記僅需要指示插入缺失區(qū)域 是否存在。任何合適的標記檢測技術可用于鑒定此類雜交標記，例如在本文提供的實例中 使用SNP技術。
[0155] "熱帶銹病"是由病原體玉米殼銹菌（Physopella zeae(Mains) Cummins&Ramachar)(與Angiopsora zeae Mains同義）引起的病害。該病害特征在于在 玉米葉片上形成小的黃色圓形膿皰。這些夏孢子階段膿皰常常以小群存在并且葉片表皮 層覆蓋發(fā)展中的夏孢子。倒卵球形至橢圓形的夏孢子通過在表皮層中形成的小縫或小孔 釋放。雖然夏孢子是幾乎無色的，它們的釋放使得膿皰具有白色或奶油色的外觀。一些 玉米基因型顯示具有較暗顏色（紅色至略帶紫色的顏色）的膿皰，其與較傳統(tǒng)的白色/ 奶油色夏孢子不同。在夏孢子階段形成后也可發(fā)展成具有水泡狀外觀的冬孢子階段。冬 孢子（褐色至黑色）可在冬孢子堆內(nèi)發(fā)育，所述冬孢子堆圍繞著現(xiàn)有的夏孢子膿皰形成。 (Donald G. White，ed. 1999. Compendium of corn diseases。第三版，APS Press，ISBN 0-89054-234-1) 〇
[0156]"南方銹病"是由病原體多堆柄銹菌（Puccinia polysora Underw)引起的病害。該 病害特征在于主要在葉片上表面上、但是偶爾會在葉片下表面上形成小的黃色圓形膿皰， 夏孢子最常見地在靠近葉中脈處形成。這些夏孢子膿皰包含倒卵球形至橢圓形的夏孢子， 其顏色通常為橙色至橙紅色。膿皰通常為圓形至橢圓形并且在葉片上非常多。這種病原體 也可在穗殼、穗柄和葉鞘上形成夏孢子膿皰。已知存在冬孢子階段，在冬孢子堆中形成暗褐 色至黑色的冬孢子，所述冬孢子堆存在于圍繞現(xiàn)有夏孢子堆的半圓至圓形內(nèi)。
[0157]"核苷酸序列"、"多核苷酸"、"核酸序列"和"核酸片段"可互換使用，并且指作為 單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。"核苷 酸"是構(gòu)成DNA或RNA聚合物的單體單元，它由嘌呤或嘧啶堿基、戊糖和磷酸基組成。核苷 酸（通常以它們的5'-單磷酸形式存在）通過它們下述的單字母命名法指："A"指腺苷酸 或脫氧腺苷酸（分別用于RNA或DNA)，"C"指胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"指鳥苷酸或脫氧鳥 苷酸，"U"指尿苷酸，"T"指脫氧胸苷酸，"R"指嘌呤（A或G)，"Y"指嘧啶（C或T)，"K"指G 或T，"H"指A或C或T，" I "指肌苷，"N"指任何核苷酸。
[0158] 表型關系圖是基于許多特性的總體相似度、不考慮進化史或特定特性的假定顯著 性來描繪生物體間的分類學關系的圖，通常由計算機產(chǎn)生。
[0159] 術語"表型"或"表型性狀"或"性狀"指生物的一個或多個性狀。表型能夠用肉眼 或者本領域已知的任何其它評價手段觀察到，例如顯微鏡法、生物化學分析、或電裝置檢測 分析法。在某些情況下，表型由單個基因或基因座直接控制，即"單基因性狀"。在其它情況 下，表型是若干個基因的結(jié)果。
[0160] "系統(tǒng)發(fā)育樹"是顯示不同生物物種或?qū)嶓w間的推斷進化關系的圖，所述推斷基于 它們的物理和/或基因特性的相似度和差異?？墒褂枚喾N方法構(gòu)建它們，包括但不限于距 離-矩陣法如連續(xù)法或UPGMA，它們從多重序列比對中計算遺傳距離。
[0161] 基因組的"物理圖譜"是顯示染色體DNA上可辨認的界標（包括基因、標記等）的 線性順序的圖譜。然而與基因圖譜相比，界標間的距離是絕對的（例如以堿基對測量的或 分離的或重疊的連續(xù)基因片段）并且不基于基因重組。
[0162] "植株"可為整個植株、其任何部分、或來源于植株的細胞或組織培養(yǎng)物。因此，術 語"植株"可指代以下任何一種材料：整個植株、植株部分或器官（例如葉片、莖、根等）、植 株組織、種子、植株細胞、和/或子代的相同材料。植株細胞是從植株中獲取的細胞或來源 于從植株中所獲取細胞經(jīng)培養(yǎng)出的細胞。
[0163] "多態(tài)性"是DNA中的變型，它過于常見而不僅僅由突變產(chǎn)生。多態(tài)性在種群中必 須具有至少1%的頻率。多態(tài)性可以是單核苷酸多態(tài)性或SNP、或插入/缺失多態(tài)性，所述 插入/缺失多態(tài)性本文也稱為"插入缺失"。
[0164] "概率值"或"p值"是表型的特定組合和特定標記等位基因的存在或不存在是否 隨機的統(tǒng)計學概率。因此，概率評分越低，表型和特性標記將共分離的可能性越大。在某些 方面，認為概率評分是"顯著的"或"不顯著的"。在一些實施方案中，認為隨機分離的概率 評分為〇. 05(P= 0. 05,或5 %的概率）是共分離的顯著性指示。然而，可接受的概率可為 小于50% (p = 0. 5)的任何概率。例如，顯著概率可小于0. 25、小于0. 20、小于0. 15、小于 0. 1、小于0. 05、小于0. 01、或小于0. 001。
[0165] 每個"PHM"標記代表當用于擴增特定DNA片段的巢式PCR時的兩組引物（外部引 物和內(nèi)部引物）。一組外部引物用于第一輪PCR，之后內(nèi)部序列用于對第一輪PCR的產(chǎn)物進 行第二輪PCR。這提高了反應的特異性。本文所述的全部PHM標記在表2中列出，并且這些 引物的退火溫度為55°C。
[0166] "產(chǎn)品標記"或"生產(chǎn)SNP標記"是已經(jīng)為高通量目的而開發(fā)的標記。開發(fā)生產(chǎn)SNP 標記以使用PHM標記和巢式PCR分析鑒定特定多態(tài)性（參見例如表1中的PHM1192-26-U)。 設計生產(chǎn)SNP標記以與Invader P〗us:fc (Third Wave Technologies)平臺一起使用。
[0167] "參考序列"是用作序列比對基準的限定序列。參考序列通過基因分型在該基因座 的多個品系、在序列比對程序中比對核苷酸序列（例如Sequencher)、然后獲取比對的共有 序列而獲得。因此，參考序列鑒定在基因座等位基因中的多態(tài)性。參考序列可以不是實際 DNA序列的拷貝；然而，設計引物和探針用于基因座中的實際多態(tài)性是有用的。
[0168] 術語"子代"指雜交產(chǎn)生的后代。
[0169] "子代植株"從兩個植株間的雜交生成。
[0170] 術語"數(shù)量性狀基因座"或"QTL"指在至少一種遺傳背景下（例如在至少一個育 種種群中），具有與表型性狀的差異表達關聯(lián)的DNA區(qū)域。QTL與基因或引起所討論的性狀 的基因緊密連鎖。
[0171]"頂交測試"是用來源于每個親本與相同測試者（通常是純合品系）雜交的子代進 行的測試。測試親本可為自由授粉的品種、雜交品系或自交系。
[0172] 短語"在嚴格條件下"指在該條件下探針或多核苷酸將與特定核酸序列雜交，雜交 通常在核酸混合物中進行，但是基本上無其它序列。嚴格條件是序列依賴性的并將因不同 的環(huán)境而異。
[0173]標記的"不利等位基因"是與不利植株表型共分離的標記等位基因，因此提供鑒定 能從育種程序或栽培中移除的植株的有益效果。
[0174]較長序列具體地在較高溫度下雜交。特定序列在限定離子強度、pH的情況下，嚴 格條件通常選擇比熱解鏈溫度（Tm)低約3-5°C。Tm是（在限定離子強度、pH和核酸濃度 的情況下）50%與靶互補的探針平衡雜交到靶序列上（因為存在的靶序列過多，在Tm 50% 的探針被平衡占用）的溫度。嚴格條件將是如下那些條件：在pH為7. 0-8. 3下鹽濃度低于 約1. 0M鈉離子，通常約0. 01-1. 0M鈉離子濃度（或其它鹽），并且對于短探針（例如10-50 個核苷酸）溫度為至少約30°C，而對于長的探針（例如多于50個核苷酸）溫度為至少約 60°C。嚴格條件也可以通過加入諸如甲酰胺之類的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)。就選擇性雜交或特 異性雜交而言，陽性信號是至少兩倍于背景，優(yōu)選10倍于背景雜交。示例性的嚴格雜交條 件通常是：50%的甲酰胺，5x SSC，和1%的SDS，在42°C下孵育，或者5x SSC，1%的SDS，在 65°C下孵育，并用0. 2x SSC以及0. 1%的SDS在65°C下洗滌。就PCR而言，約36°C的溫度 是典型的低嚴格擴增，而退火溫度取決于引物長度，其可介于約50°C和65°C之間。決定雜 交參數(shù)的附加準則在多個參考文獻中被提供。
[0175]序列比對和百分比同一性可用設計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定，這 些方法包括但不限于LASEROEME1^物信息計算包（DNASTAR? Inc.，Madison， WI)的MEGALIGW程序。除非另行指出，本文提供的序列的多重比對用Clustal V比對 方法（Higgins和Sharp，CABI0S. 5 :151-153 (1989))采用默認參數(shù)（空位罰分=10,空位 長度罰分=10)執(zhí)行。成對比對和使用Clustal V方法的蛋白序列百分比同一性計算的默 認參數(shù)是KTUPLE = 1，空位罰分=3,窗=5,DIAGONALS SAVED = 5。就核酸而言，這些參 數(shù)為 KTUPLE = 2,空位罰分=5,窗=4,DIAGONALS SAVED = 4。在使用 Clustal V 程序的 序列比對后，觀看相同程序上的"序列距離"表可能獲得"百分比同一性"和"趨異度"值；除 非另行指出，本文提供的和申明的百分比同一性和趨異度是以該方式計算。
[0176]"Clustal V序列比對方法"對應于Clustal V標記的比對方法（描述于Higgins and Sharp，CABI0S. 5:151-153 (1989) ;Higgins，D.G?等人（1992) Comput.Appl.Biosci. 8: 189-191)并存在于LASERGENE生物信息計算包（DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM 程序中。對于多重比對，默認參數(shù)對應于空位罰分=10和空位長度罰分=10。成對比對 和使用Clustal V方法的蛋白序列百分比同一性計算的默認參數(shù)是KTUPLE = 1，空位罰分 =3,窗=5, DIAGONALS SAVED = 5。就核酸而言，這些參數(shù)是KTUPLE = 2,空位罰分=5， 窗=4, DIAGONALS SAVED = 4。在使用Clustal V程序的序列比對后，觀看相同程序中的 "序列距離"表可能獲得"百分比同一性"值。
[0177]本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域所熟知的并且在如下文獻中 有更全面的描述：Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F?和 Maniatis，T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual'，；Cold Spring Harbor Laboratory Press ：Cold Spring Harbor， 1989 (下文稱為 "Sambrook"）。
[0178] 在詳述本發(fā)明之前，應當了解本發(fā)明不受特定實施方案的限制。也應當了解本文 所用的術語僅是為了描述特定實施方案，而不旨在進行限制。當在本文和所附權(quán)利要求中 使用時，除非內(nèi)容清楚地表明，單數(shù)和單數(shù)形式的術語包括復數(shù)指代。因此，例如術語"一個 植株"也包括多個植株；取決于上下文，使用的術語"植株"也可包括該植株遺傳相似或相同 的子代；使用的術語"核酸"任選地包括該核酸分子的多個拷貝。
[0179] 熱帶銹病抗件
[0180] 熱帶銹病是由病原體玉米殼銹菌（Physopella zeae)引起的玉米真菌病害。與熱 帶銹病抗性相關聯(lián)的分子標記和等位基因的鑒定僅基于子代的基因組成進行選擇。本文提 供了通過評價基因組成（使用分子標記和它們的等位基因進行評價）鑒定并選擇具有增強 熱帶銹病抗性的玉米植株的方法。
[0181] 基_作圖
[0182] 在相當一段時間內(nèi)已經(jīng)認識到生物基因組中與特定表型如熱