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鑒別水稻千粒重基因tgw6野生型和突變體的分子標(biāo)記的制作方法

文檔序號(hào):8937953閱讀:1014來源:國(guó)知局
鑒別水稻千粒重基因tgw6野生型和突變體的分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及一種鑒別水稻千粒重基因TGW6野生型 和突變體的分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 千粒重是水稻產(chǎn)量S要素之一,迄今已有7個(gè)控制水稻粒重和粒形的giL得到克 隆,其中,TGW6是由Ishimaru等(2013)應(yīng)用化卵onbare/Kasalath所衍生的回交近交系 定位并克隆的,它編碼嗎I噪乙酸-葡糖糖水解酶的基因,同時(shí)控制粒長(zhǎng)和千粒重。該基因位 于水稻第6染色體長(zhǎng)臂C358附近,序列比對(duì)和遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明:Kasalath的TGW6等位 基因?yàn)楣δ苋笔蛔?,引起胚乳中嗎I噪乙酸含量下降,進(jìn)而使細(xì)胞數(shù)量增加,粒長(zhǎng)變長(zhǎng)、粒 重增加。
[0003]CRISPR/tas9系統(tǒng)是2013年開發(fā)的一種快速、簡(jiǎn)單的對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯的新 技術(shù),該技術(shù)不僅在模式植物擬南芥中得到應(yīng)用,也在玉米、水稻、小麥、高梁等禾本科作物 中也取得了突破。水稻上,已有3個(gè)不同的研究組成功利用CRISPR/tas9系統(tǒng)對(duì)PDS、MPK2、 BAD肥、0s02g23823、OsSWEETll、0sSWEET14、R0C5、SPP和YSA等基因進(jìn)行精確編輯,得到了 預(yù)期的序列變異及突變表型。由于CRISPR/tas9系統(tǒng)只是通過識(shí)別祀序列后進(jìn)行剪切,再 利用宿主自身的DNA修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)編輯,轉(zhuǎn)入的載體及其攜帶的抗性篩選標(biāo)記 可W在自交后代中獲得不存在轉(zhuǎn)基因成分的植株,從而可W避免由轉(zhuǎn)基因可能引起的安全 和倫理問題。
[0004] 為提高Cas-tgw6突變體在育種中的利用效率,開發(fā)一種用于區(qū)分Cas-tgw6突變 體與其它常規(guī)水稻品種的分子標(biāo)記,W實(shí)現(xiàn)TGW6等位基因型的有效、可靠、快速鑒定,在后 續(xù)利用Cas-tgw6突變體進(jìn)行育種群體篩選中具有重要價(jià)值。雖然王軍等(2014)《水稻千 粒重基因TGW6功能標(biāo)記的開發(fā)與利用》(中國(guó)水稻科學(xué)2014,28(5) :473-478)的文章中開 發(fā)了一種針對(duì)千粒重基因TGW6功能標(biāo)記,但該標(biāo)記不能有效區(qū)分化s-tgw6突變體,而且還 需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切才能區(qū)分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn),本發(fā)明的首要目的在于提供一種鑒別水稻千粒 重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述分子標(biāo)記的應(yīng)用。
[0007] 一種鑒別水稻千粒重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記,與野生型位點(diǎn)檢測(cè) 相關(guān)的標(biāo)記化s-tgw6-l的核巧酸序列如下所示:
[0008]CAACCAAACCAAAGCCTGCAGCTGCAGCGAACGAGAGCACCAGCACGAGAGCCAAGCGTACGTGCAGTG CAGCCAACTGATCAGACTGAGACAGCGCGCGTACACGGCCGAGCTCCTACAGGCTACAGCCATGAGAAGCACGGCGA GGCAAGCGGCGACCGCGGCGGCGTTCGCGCTCATTGTCTTCCTCGTGCTGCTCTCGCCGTCCCCTACTGCCGCCGCC ACAGCCACAACGAGAATGTTCAAGACCATTGACGCCCGGCGGAGCCAGCATCTGGACCTCGGCGGATCACTGGTCGG CCCGGAGAGCGTCGCGTTCGACGGCAAAGGCCGCGGCCCGTACAGCGGCGTCTCCGACGGCCGCATCATGAGGTGGA ACGGCGAGGCCGCTGGCTGGAGCACCTACACGTACAGCCCCAGCTACACGAAAAACAAGTGCGCGGCATCGACTCTC CCCACGGTCCAGACCGAGAGCAAATGCGGCCGCCCGTTAGGCCTACGGTTTCACTACAAAACCGGCAACCTGTACAT CGCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTG;
[0009] 所述的水稻品系為H447 ;
[0010] 所述的H447為R819/玉香占//R8I9BC2F7代穩(wěn)定品系,即先將R819與玉香占雜 交,再將雜交后代與R819回交兩次后再自交7代后所得的穩(wěn)定品系;
[0011] 所述的水稻千粒重基因tgw6突變體為化s-tgw6。、Cas-tgw6b或化s-tgw6C;
[0012] 與突變體化s-tgw63位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記化s-tgw6-2的核巧酸序列如下所示:
[0013] CAACCAAACCAAAGCCTGCAGCTGCAGCGAACGAGAGCACCAGCACGAGAGCCAAGCGTACGTGCAGTG CAGCCAACTGATCAGACTGAGACAGCGCGCGTACACGGCCGAGCTCCTACAGGCTACAGCCATGAGAAACTACAAAA CCGGCAACCTGTACATCGCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTG;
[0014] 與突變體化s-tgw6b位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記化s-tgw6-3的核巧酸序列如下所示:
[0015] CAACCAAACCAAAGCCTGCAGCTGCAGCGAACGAGAGCACCAGCACGAGAGCCAAGCGTACGTGCAGTG CAGCCAACTGATCAGACTGAGACAGCGCGCGTACACGGCCGAGCTCCTACAGGCTACAGCCATGGGGCGGATCACTG GTCGGCCCGGAGAGCGTCGCGTTCGACGGCAAAGGCCGCGGCCCGTACAGCGGCGTCTCCGACGGCCGCATCATGAG GTGGAACGGCGAGGCCGCTGGCTGGAGCACCTACACGTACAGCCCCAGCTACACGAAAAACAAGTGCGCGGCATCGA CTCTCCCCACGGTCCAGACCGAGAGCAAATGCGGCCGCCCGTTAGGCCTACGGTTTCACTACAAAACCGGCAACCTG TACATCGCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTG;
[0016] 與突變體化s-tgw6。位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記化s-tgw6-4的核巧酸序列如下所示:
[0017] CAACCAAACCAAAGCCTGCAGCTGCAGCGAACGAGAGCACCAGCACGAGAGCCAAGCGTACGTGCAG TGCAGCCAACTGATCAGACTGAGACAGCGCGCGTACACGGCCGAGCTCCTACAGGCTACAGCCATGAGAATGTTC AAGACCATTGACGCCCGGCGGAGCCAGCATCTGGACCTCGGCGGATCACTGGTCGGCCCGGAGAGCGTCGCGTTC GACGGCAAAGGCCGCGGCCCGTACAGCGGCGTCTCCGACGGCCGCATCATGAGGTGGAACGGCGAGGCCGCTGGC TGGAGCACCTACACGTACAGCCCCAGCTACACGAAAAACAAGTGCGCGGCATCGACTCTCCCCACGGTCCAGACC GAGAGCAAATGCGGCCGCCCGTTAGGCCTACGGTTTCACTACAAAACCGGCAACCTGTACATCGCCGACGCCTAC ATGGGATTGATGCGAGTTG;
[0018] 一種用于鑒定上述水稻千粒重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記的引物為:
[0019] 上游引物TGW6-F: 5' -CAACCAAACCAAAGCCTGC-3';
[0020] 下游引物TGW6-R:5' -CAACTCGCATCAATCCCATG-3';
[0021] 所述的鑒別水稻千粒重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記在水稻種質(zhì)資源鑒 定或育種輔助選育中的應(yīng)用;
[0022] 所述的用于鑒定水稻千粒重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記的引物在水稻 種質(zhì)資源鑒定或育種輔助選育中的應(yīng)用;
[0023] 上述應(yīng)用,優(yōu)選包含如下步驟:
[0024] (1)利用上游引物TGW6-F和下游引物TGW6-R對(duì)水稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;
[002引 似對(duì)步驟(1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析:
[0026] 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小563bp的DNA片段,則為野生型tgw6wt;
[0027] 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小194bp的DNA片段,則為突變體Cas-tgw63;
[0028] 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小414bp的DNA片段,則為突變體化s-tgw6b;
[0029] 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小46化P的DNA片段,則為突變體化s-tgw6。;
[0030] 步驟(1)所述的PCR擴(kuò)增體系優(yōu)選為15yL反應(yīng)體系,包含如下組分:
[0031] 基因組 DNA(20 ~200ng4iL) 1 批L 上游引物TGW6-F 化3講一 下游引物TGW6-民(10叫M) 0.3 pL 2xPowefTaqPCRMasterMix 7.5 jiL ddH.O 補(bǔ)山 15}iL;
[0032] 步驟(I)所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序優(yōu)選為:
[0033] 94。(:預(yù)變性5111111;94^4〇36。,59^4〇36。,72^3〇36。,35個(gè)循環(huán);72。(:再延伸 IOmin;
[0034] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0035] (1)開發(fā)了一種用于區(qū)分水稻千粒重基因tgw6突變體與其它常規(guī)水稻品種的分 子標(biāo)記化s-tgw6-l,W實(shí)現(xiàn)tgw6等位基因型的有效、可靠、快速鑒定,在后續(xù)利用水稻千粒 重基因tgw6突變體進(jìn)行育種群體篩選中具有重要價(jià)值。
[0036] 似本發(fā)明是針對(duì)CRISPR/tas9特異修飾的位點(diǎn),設(shè)計(jì)了一對(duì)引物W特異擴(kuò)增不 同類型的水稻千粒重基因tgw6突變體,利用該標(biāo)記引物,可W通過簡(jiǎn)單的電泳片段大小比 較即可區(qū)分基因型變化,提高了檢測(cè)效率。
[0037] (3)本發(fā)明的功能標(biāo)記化s-tgw6-l,利用普通PCR技術(shù),能夠特異檢測(cè)水稻千粒 重基因tgw6突變體,僅需進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增和電泳,可對(duì)不同的水稻材料水稻千粒重基因 tgw6突變體等位基因進(jìn)行基因分型,并可作為一種分子標(biāo)記應(yīng)用育種雜交、回交分離群體 進(jìn)行鑒定,提高分子標(biāo)記輔助選擇育種效率。本發(fā)明是應(yīng)用PCR技術(shù),不需酶切PCR產(chǎn)物、 不需進(jìn)行多次PCR擴(kuò)增、不需測(cè)序,操作簡(jiǎn)便、省時(shí)且價(jià)格低廉。
【附圖說明】
[003引圖1是TGW6基因祀點(diǎn)序列引物設(shè)計(jì)及祀點(diǎn)組裝示意圖,其中,A:3個(gè)祀點(diǎn)在TGW6 基因上的位置;B:各曲NA表達(dá)盒在載體pYLCRISPRA:as9Pubi-H中的組裝方式,黑色方框代 表祀序列引物所在位置。
[0039] 圖2是利用TGW6基因祀位點(diǎn)附近的特異引物對(duì)突變體的檢測(cè)結(jié)果,其中,M:1化 DNAladder;1 :水稻材料H447 (野生型);2~22 :tgw6突變體。
[0040] 圖3是部分tgw6純合缺失突變體的突變點(diǎn)的測(cè)序分析圖,其中"示為省 略序列,"----"示為缺失序列;WT為水稻材料H447,4、18及8分別為tgw6缺失突變體 C曰S-tgW0a、C曰S-tgW0b及C曰S-tgw6e
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