//R8I9BC2F7代穩(wěn)定品系）（編 號1)、水稻中間材料水稻千粒重基因tgw6突變體（Cas-tgw6a、Cas-tgw6b和化s-tgw6。）（編 號2~4)。選取水稻單株嫩葉，采用CTAB法提取水稻基因組DNA，具體步驟如下：①取適 量新鮮葉片放在2mL離屯、管中加液氮搗碎，向離屯、管中加入ImLCTAB抽提液，搖勻；②置于 65°C的水浴鍋中，每隔IOmin輕輕搖動一次；③30~45min后取出，冷卻2min后，加入等體 積氯仿/異戊醇（V:V= 24:1)，上下劇烈搖動，充分混合均勻；④15, 000巧m/min離屯、IOmin 后取出；⑥小屯、吸取上清液至新的滅菌離屯、管中，然后加入600yL預(yù)冷的異丙醇，上下輕 輕搖動，使異丙醇與水層充分混合；⑧-20°C放置20min，使DNA充分沉淀；⑦10,OOOrpm/ min瞬間離屯、，立即倒掉液體，再將離屯、管倒立于鋪開的紙巾上；⑨靜置Imin后加入800yL 70%的乙醇將DNA漂洗一次；⑨通風(fēng)楓內(nèi)干燥DNA后加入IOOiiLIXTEBuffer,使DNA充 分溶解；⑩置于-20°C保存、備用。
[0110] (2)利用鑒別水稻千粒重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記及其鑒定引物分 析4個水稻材料tgw6基因型
[0111] 利用鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為15 y L :1 y L的模板DNA，10 ymol/L的 一對引物燈GW6-F和TGW6-R)各0. 3yL，7. SyL 2X化wer Taq PCR Master Mix,其余 由雙蒸滅菌水（d地2〇)補(bǔ)足；PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min，（94°C 40sec，59°C 40sec， 72°C30sec)35個循環(huán)，72°C再延伸IOmin ;在GeneAmp'llPCRSystem 9700型PCR儀 (Applied Biosystems, USA)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0112] (3)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測和基因型判定
[om]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖巧％Goldview染液）凝膠電泳（電泳緩沖液1XTAE， 電壓140V，時間30min)，利用BIORAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，發(fā)現(xiàn)利用本發(fā)明鑒定引物和 反應(yīng)條件能夠特異性擴(kuò)增出單一、清晰和非常明亮的條帶，且片段大小位置可W明顯區(qū)分， 即563bp、194bp、415bp、460bp處，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物大小，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序進(jìn)行驗(yàn)證，對 基因型進(jìn)行判定（圖5):
[0114] 擴(kuò)增產(chǎn)物大小在凝膠上對應(yīng)550bp處，對應(yīng)563bp的擴(kuò)增片段，顯示標(biāo)記個體基因 型為tgw6…t;
[0115] 擴(kuò)增產(chǎn)物大小在2(K)bp附近，對應(yīng)194bp的擴(kuò)增片段，顯示標(biāo)記個體基因型為 Cas-tgw6^；
[0116] 擴(kuò)增產(chǎn)物在4(K)bp附近，對應(yīng)414bp的擴(kuò)增片段，顯示標(biāo)記個體基因型為 Cas-tgw6b;
[0117] 擴(kuò)增產(chǎn)物在46化P附近，對應(yīng)46化P的擴(kuò)增片段，顯示標(biāo)記個體基因型為 Cas-tgw6e。
[0118] 上述基因型判讀結(jié)果與材料符合，證明開發(fā)的標(biāo)記可有效區(qū)分四種基因型。
[0119] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒別水稻千粒重基因 TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記，其特征在于：與野生型 位點(diǎn)檢測相關(guān)的標(biāo)記Cas-tgw6-l的核苷酸序列如下所示： CAACCAAACCAAAGCCTGCAGCTGCAGCGAACGAGAGCACCAGCACGAGAGCCAAGCGTACGTGCAGTGCA GCCAACTGATCAGACTGAGACAGCGCGCGTACACGGCCGAGCTCCTACAGGCTACAGCCATGAGAAGCACGGCGAG GCAAGCGGCGACCGCGGCGGCGTTCGCGCTCATTGTCTTCCTCGTGCTGCTCTCGCCGTCCCCTACTGCCGCCGCCA CAGCCACAACGAGAATGTTCAAGACCATTGACGCCCGGCGGAGCCAGCATCTGGACCTCGGCGGATCACTGGTCGGC CCGGAGAGCGTCGCGTTCGACGGCAAAGGCCGCGGCCCGTACAGCGGCGTCTCCGACGGCCGCATCATGAGGTGGAA CGGCGAGGCCGCTGGCTGGAGCACCTACACGTACAGCCCCAGCTACACGAAAAACAAGTGCGCGGCATCGACTCTCC CCACGGTCCAGACCGAGAGCAAATGCGGCCGCCCGTTAGGCCTACGGTTTCACTACAAAACCGGCAACCTGTACATC GCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTG。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別水稻千粒重基因 TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記，其特 征在于： 所述的水稻品系為H447 ; 所述的水稻千粒重基因 tgw6突變體為Cas_tgw6a、Cas_tgw6bS Cas_tgw6 e。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別水稻千粒重基因 TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記，其特 征在于： 與突變體Cas_tgw6a位點(diǎn)檢測相關(guān)的標(biāo)記Cas-tgw6_2的核苷酸序列如下所示： CAACCAAACCAAAGCCTGCAGCTGCAGCGAACGAGAGCACCAGCACGAGAGCCAAGCGTACGTGCAGTGCA GCCAACTGATCAGACTGAGACAGCGCGCGTACACGGCCGAGCTCCTACAGGCTACAGCCATGAGAAACTACAAAAC CGGCAACCTGTACATCGCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTG。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別水稻千粒重基因 tgw6野生型和突變體的分子標(biāo)記，其特 征在于： 與突變體Cas_tgw6b位點(diǎn)檢測相關(guān)的標(biāo)記Cas-tgw6_3的核苷酸序列如下所示： CAACCAAACCAAAGCCTGCAGCTGCAGCGAACGAGAGCACCAGCACGAGAGCCAAGCGTACGTGCAGTGCA GCCAACTGATCAGACTGAGACAGCGCGCGTACACGGCCGAGCTCCTACAGGCTACAGCCATGGGGCGGATCACTGG TCGGCCCGGAGAGCGTCGCGTTCGACGGCAAAGGCCGCGGCCCGTACAGCGGCGTCTCCGACGGCCGCATCATGAGG TGGAACGGCGAGGCCGCTGGCTGGAGCACCTACACGTACAGCCCCAGCTACACGAAAAACAAGTGCGCGGCATCGAC TCTCCCCACGGTCCAGACCGAGAGCAAATGCGGCCGCCCGTTAGGCCTACGGTTTCACTACAAAACCGGCAACCTGT ACATCGCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTG。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別水稻千粒重基因 TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記，其特 征在于： 與突變體Cas_tgw6e位點(diǎn)檢測相關(guān)的標(biāo)記Cas-tgw6_4的核苷酸序列如下所示： CAACCAAACCAAAGCCTGCAGCTGCAGCGAACGAGAGCACCAGCACGAGAGCCAAGCGTACGTGCAGTGCA GCCAACTGATCAGACTGAGACAGCGCGCGTACACGGCCGAGCTCCTACAGGCTACAGCCATGAGAATGTTCAAGAC CATTGACGCCCGGCGGAGCCAGCATCTGGACCTCGGCGGATCACTGGTCGGCCCGGAGAGCGTCGCGTTCGACGG CAAAGGCCGCGGCCCGTACAGCGGCGTCTCCGACGGCCGCATCATGAGGTGGAACGGCGAGGCCGCTGGCTGGAG CACCTACACGTACAGCCCCAGCTACACGAAAAACAAGTGCGCGGCATCGACTCTCCCCACGGTCCAGACCGAGAG CAAATGCGGCCGCCCGTTAGGCCTACGGTTTCACTACAAAACCGGCAACCTGTACATCGCCGACGCCTACATGGG ATTGATGCGAGTTGo6. -種用于鑒定權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的水稻千粒重基因 TGW6野生型和突變體 的分子標(biāo)記的引物，其特征在于所述的引物為： 上游引物 TGW6-F : 5 ' -CAACCAAACCAAAGCCTGC-3'; 下游引物 TGW6-R:5' -CAACTCGCATCAATCCCATG-3'。7. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的鑒別水稻千粒重基因 TGW6野生型和突變體的分子標(biāo) 記在水稻種質(zhì)資源鑒定或育種輔助選育中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求6所述的用于鑒定水稻千粒重基因 TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記的引 物在水稻種質(zhì)資源鑒定或育種輔助選育中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于鑒定水稻千粒重基因 TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記 的引物在水稻種質(zhì)資源鑒定或育種輔助選育中的應(yīng)用，其特征在于包含如下步驟： (1) 利用權(quán)利要求6所述的引物TGW6-F和TGW6-R對水稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (2) 對步驟（1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析： 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小563bp的DNA片段，則為野生型tgw6wt; 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小194bp的DNA片段，則為突變體Cas-tgw6a; 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小414bp的DNA片段，則為突變體Cas-tgw6b; 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小461bp的DNA片段，則為突變體Cas-tgw6。。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于鑒定水稻千粒重基因 TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記 的引物在水稻種質(zhì)資源鑒定或育種輔助選育中的應(yīng)用，其特征在于： 步驟（1)所述的PCR擴(kuò)增體系為15 μ L反應(yīng)體系，包含如下組分：步驟（1)所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序： 94°C預(yù)變性 5min ;94°C 40sec，59°C 40sec，72°C 30sec，35 個循環(huán)；72°C再延伸 IOmin0
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別水稻千粒重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記。所述的鑒別水稻千粒重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記，與野生型位點(diǎn)檢測相關(guān)的標(biāo)記Cas-tgw6-1的核苷酸序列SEQ？ID？No.1所示。用于鑒定上述水稻千粒重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記的引物為：上游引物TGW6-F：5′-CAACCAAACCAAAGCCTGC-3′；下游引物TGW6-R：5′-CAACTCGCATCAATCCCATG-3′；所述的鑒別水稻千粒重基因TGW6野生型和突變體的分子標(biāo)記或引物可以應(yīng)用于水稻種質(zhì)資源鑒定或育種輔助選育中。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105154531
【申請?zhí)枴緾N201510449502
【發(fā)明人】王加峰, 郭濤, 羅文龍, 周丹華, 陳志強(qiáng), 王慧
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年7月28日