。
[00川 圖4是本發(fā)明功能標(biāo)記Cas-tgw6-l及其鑒定引物設(shè)計(jì)示意圖，TGW6F、TGW6R:鑒 定引物；黑色背景：等位變異缺失區(qū)段。
[0042] 圖5是利用功能標(biāo)記化s-tgw6-l及其鑒定引物鑒定不同的水稻千粒重基因tgw6 基因型的結(jié)果分析圖，其中，M:100bpDNAladder;l:水稻品系為H447(R819/玉香占// R8I9BC2F7代穩(wěn)定品系）；2~4 :水稻千粒重基因tgw6突變體（Cas-tgw6ae)。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0044]載體P化-U3-gRNA、P化-U6a-gRNA和P化-冊(cè)b-gRNAW及載體pYLCRISPR/ Cas9Pubi-H均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供（MaX，ZhangQ，ZhuQ，LiuW，ChenY，Qiu R,WangB,YangZ. 2015.ArobustCRISPR/Cas9systemforconvenient,high-efficiency multiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants.MolPlant,doi:10.1016/ j.molp. 2015. 04. 007)；
[004引水稻品系H447為R819/玉香占//R8I9BC2F7代穩(wěn)定品系，即為先將R819與玉香占 雜交，再將雜交后代與R819回交兩次后再自交7代后所得的穩(wěn)定品系；
[0046] 實(shí)施例1基于CRISPR/tas9技術(shù)的水稻千粒重基因tgw6缺失突變體的創(chuàng)建
[0047] (1)引導(dǎo)RNA(guideRNA，gRNA)祀點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)
[004引根據(jù)調(diào)控水稻粒長(zhǎng)及千粒重基因TGW6的基因組序列（GenBank:AB513135. 1)，設(shè) 計(jì)3個(gè)祀向千粒重基因TGW6的gRNA。20nt的寡核巧酸gRNA祀點(diǎn)序列按A/G(N) 20NGG序 列進(jìn)行設(shè)計(jì)，同時(shí)將設(shè)計(jì)好的曲NA祀點(diǎn)序列進(jìn)行水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)W排除非特異性 的祀切位點(diǎn)，具體寡核巧酸序列見表1和圖1。
[0049] 表1 gRNA祀點(diǎn)的寡核巧酸序列
[0050]
[0051] (2)S祀點(diǎn)CRISPR/Cas9-gRNA載體的構(gòu)建
[0052]參照Ma等人（Ma)(，ZhangQ,ZhuQ,LiuW,ChenY,QiuR,WangB,YangZ. 2015. ArobustCRISPR/CasQsystemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenome editinginmonocotanddicotplants.MolPlant,doi:10. 1016/j.molp. 2015. 04. 007)的 方法，取等量的上游與下游曲NA寡核巧酸鏈（步驟（I))混合（終濃度IiiM)，90°C30S，移 至室溫冷卻完成退火形成雙鏈接頭；取pYkU3-gRNA、P化-U6a-gRNA及pYkTOb-gRNA質(zhì)粒 各1yg，在20yL反應(yīng)體系中用IOUBsaI(肥B公司）酶切20min，然后將酶切過(guò)的pYkU3/ U6a/冊(cè)b-gRNA載體與各自所對(duì)應(yīng)的雙鏈接頭利用T4DNAIigase22°C連接30min后，得到 3個(gè)gRNA表達(dá)盒扣3、U6a、U6b)，其中，具體連接體系為：
[0053] I〇xT4DNAIigasebu化rI沁； 酶切后的pY^U3/U6a/U化-gRNA載體 0.5f.iL; 接頭 LO陣； T4DNAHgase 35U; ddH.O 全I(xiàn)OpL
[0054] 然后分別用表2中所列各對(duì)引物對(duì)各個(gè)gRNA表達(dá)盒扣3、U6a、U6b)進(jìn)行擴(kuò)增：
[0055] 表2擴(kuò)增各祀點(diǎn)曲NA表達(dá)盒的引物
[0056]
[0057] 具體的擴(kuò)增體系為：
[0058] 10'^BufferforKOD-Plus 2.5 ^L; KODplus聚作酶（5U/曲） 0.5 陣； 25mMMgS〇4 1uL； 2i-nMdNTPs 2.5uL； 上下游引物（I(HtM) 各0.5陣：
[0059] 連接產(chǎn)物模板DNA 2^iL CldHzO 補(bǔ)至巧^也；
[0060]然后進(jìn)行W下反應(yīng)：95°CImin;95°C15sec、55°C15sec、68°C20secl0 循環(huán)； 95°C15sec、60°C15sec68°C20sec17 ~20 循環(huán)。
[0061] 將運(yùn)S個(gè)祀點(diǎn)曲NAPCR產(chǎn)物混合后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，純化產(chǎn)物經(jīng)20UBsaI 37°C酶切30min并純化后，將其與經(jīng)BsaI酶切的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H片段利用T4DNA連 接酶2(TC連接約化，具體連接體系為：
[0062] I〇xT4DNAIigasebufferU山； 故證酶切后的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H載體 4陣; gDNAPC民產(chǎn)物 3叫 T4DNAIigase 1.陣； ddH.O 生10 沁；
[0063] 最后轉(zhuǎn)化D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞并挑取陽(yáng)性單克隆個(gè)片段的連接順序是 U3-U6a-U6b)后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證（由Invitrogen公司完成），得到S祀點(diǎn)CRISPR/Cas9-gRNA 載體。
[0064] 實(shí)施例2
[0065] (1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻愈傷遺傳轉(zhuǎn)化
[0066] 將實(shí)施例1組裝好的CRISPR/化s9-gRNA載體通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌
[0067]EHA105 中。PCR檢測(cè)（引物為：hptF:5，-TCCGGAGCCTCCGCTCGAAGTAG-3，、hptR: 5' -CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3')為陽(yáng)性的克隆用于侵染水稻材料H447(R819/玉針香 //R819的BC2F7)的愈傷組織，侵染方法參照化ei等（1994)的方法進(jìn)行，獲得轉(zhuǎn)基因水稻 植株。
[0068] (2)水稻基因組DNA提取及突變體的PCR檢測(cè)及測(cè)序分析
[006引采用CTAB法提取步驟（1)中獲得的水稻植株的基因組DNA，對(duì)潮霉素基因檢測(cè)為 陽(yáng)性的植株利用引物化s9-TGW6testF和化s9-TGW6testR對(duì)tgw6突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR檢測(cè)， 其中鑒定引物為：
[0070]Cas9-TGW6-test-F:5> -CAACCAAACCAAAGCCTGC-3>;
[0071]Cas9-TGW6-test-R:5>-CCAATGCCTCATCAACTTAC-3>;
[0072] PCR擴(kuò)增體系為：
[0073] 1 OxBufferforKOD-Plus 2.5 1<：00口1^聚合酶（511/陣） 0.5 ,LiL; 25 mMMgS〇4 1 沁；
[0074] 2mMdNTPs 2.5 沖； 上、下游引物各0.5^以 模板DNA 0,5山 ddH.O 補(bǔ)全25沖；
[00巧]反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min;94°C變性30sec，55°C退火30sec，68°C延伸 60sec，32 個(gè)循環(huán)；68°C延伸 5min;
[0076]擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳（電泳緩沖液1XTAE)，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)觀 察、照相。結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物中多為片段缺失純合體，也有部分雜合突變體存在（圖2)。 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行的測(cè)序結(jié)果分析表明，tgw6突變頻率在90%W上，其中50%多為片段缺失 純合體，有40%左右是雜合突變體。
[0077] (4)無(wú)轉(zhuǎn)基因成分tgw6突變體的獲得及相關(guān)性狀調(diào)查
[0078] 將T。代轉(zhuǎn)基因植株播種成苗，苗期檢測(cè)潮霉素基因的有無(wú)，將不含潮霉素基因而 且tgw6基因位點(diǎn)有缺失的純合個(gè)體（編號(hào)為18、8的缺失純合體，分別命名為化s-tgw6\ Cas-tgwe。）種植至收獲Tl代種子，并對(duì)Tl代種子進(jìn)行千粒重調(diào)查：Cas-tgw6\Cas-tgw6e顯 著影響了水稻的千粒重，提高了千粒重5% W上。
[0079] 對(duì)于tgw6基因位點(diǎn)雙等位雜合個(gè)體（編號(hào)為4)，需自交后去除潮霉素基因影響， 得到純合缺失突變體，命名為化s-tgw63,然后計(jì)算其千粒重，同樣的，Cas-tgw63顯著影響 了水稻的千粒重，提高了千粒重5 % W上。
[0080]利用引物Cas9-TGW6testF和Cas9-TGW6testR對(duì)突變體Cas-tgwe。、Cas-tgw6b和 Cas-tgw6。的tgw6突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR檢測(cè)并測(cè)序（圖3);
[0081] 其中，突變體化s-tgw63中，千粒重基因tgw6的核巧酸序列為：
[0082] ATGAGAAACTACAAAACCGGCAACCTGTACATCGCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTGGTCCA AAAGGCGGGGAGGCAACCGTGCTAGCCATGAAGGCTGATGGCGTGCCACTTCGCTTCACCAATGGGGTGGACATTGA TCAGGTTACCGGAGATGTTTATTTCACCGACAGCAGCATGAACTACCAACGATCTCAGCACGAGCAAGTCACGGCGA CCAAGGATTCGACCGGACGGCTCATGAAGTATGACCCACGAACTAACCAAGTCACCGTTCTTCAATCCAACATAACC TACCCGAACGGTGTCGCCATGAGCGCTGACCGAACACATCTGATCGTTGCATTGACCGGGCCATGTAAGTTGATGAG GCATTGGATCCGAGGCCCGAAGACTGGCAAATCTGAACCATTTGTTGACCTGCCAGGCTATCCTGATAATGTGAGG CCTGATGGAAAAGGTGGTTATTGGATAGCGCTTCATCGCGAGAAGTATGAGCTTCCCTTTGGTCCGGATAGTCACT TGGTTGCTATGAGGGTTAGTGCTGGTGGGAAGCTGGTTCAACAGATGAGAGGACCAAAGAGCTTGAGGCCAACCGAA GTGATGGAGAGGAAGGATGGCAAAATATACATGGGAAATGTTGAATTGCCGTATGTCGGAGTCGTCAAAAGCAGCT AG；
[0083] 突變體化s-tgw6b中，千粒重基因tgw6的核巧酸序列為：
[0084] ATGGGGCGGATCACTGGTCGGCCCGGAGAGCGTCGCGTTCGACGGCAAAGGCCGCGGCCCGTACAGCGG CGTCTCCGACGGCCGCATCATGAGGTGGAACGGCGAGGCCGCTGGCTGGAGCACCTACACGTACAGCCCCAGCTACA CGAAAAACAAGTGCGCGGCATCGACTCTCCCCACGGTCCAGACCGAGAGCAAATGCGGCCGCCCGTTAGGCCTACGG TTTCACTACAAAACCGGCAACCTGTACATCGCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTGGTCCAAAAGGCGGGGA GGCAACCGTGCTAGCCATGAAGGCTGATGGCGTGCCACTTCGCTTCACCAATGGGGTGGACATTGATCAGGTTACC