一種葡萄球菌a蛋白z結(jié)構(gòu)域衍生物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種葡萄球菌蛋白A的衍生物 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,W下簡稱金葡菌）是醫(yī)院和社區(qū)獲得 性感染的主要致病菌之一，能引起人類化賊性感染、皮膚和軟組織感染、壞死性肺炎、賊毒 癥、菌血癥、骨髓炎和必內(nèi)膜炎等疾病。目前，具備多重抗生素耐藥性的金葡菌，給治療帶來 了極大的困難，特別是耐甲氧西林菌株的迅速蔓延使得單純依靠抗生素治療金黃色葡萄球 菌引發(fā)的相關(guān)疾病變得越來越不可靠。免疫治療方法能夠通過激活或增強(qiáng)機(jī)體的免疫系 統(tǒng)，與抗生素協(xié)同作用，并能降低抗生素所產(chǎn)生的選擇壓力，延緩耐藥菌的產(chǎn)生，有望解決 金葡菌感染送一棘手問題。
[0003] 葡萄球菌A蛋白（簡稱蛋白A，SPA)主要存在于金葡菌中，大約90%W上的金 葡菌菌株中含有送種成分，是金葡菌的重要毒力因子之一，具備成為良好的金葡菌疫苗 候選組分的潛力。蛋白A功能區(qū)高度保守，含有5個(gè)串聯(lián)的高度同源性的E、D、A、B、C 結(jié)構(gòu)域(UhlenM,GussB,NilssonB,etal.Completesequenceofthestaphylococcal geneencoding蛋白A.Ageneevolvedthroughmultipleduplications[J].JBiol 化em. 1984, 259 (3) : 1695-1702)。為提高蛋白A的耐堿能力，與IgG結(jié)合力較強(qiáng)的B結(jié)構(gòu)域 殘基位點(diǎn)29的Gly被定向誘變成Ala,新結(jié)構(gòu)域被命名為Z(孟照輝，林兵，謝月輝，等.Fc 段受體結(jié)合蛋白（SPA-SPG)基因克隆表達(dá)及其在IgG純化中的應(yīng)用.生物化學(xué)與生物物理 進(jìn)展.2004, 31 (2) : 146-149.)。同時(shí)由于IgGFc段與蛋白A存在較強(qiáng)的親和力，致使其可 與吞瞻細(xì)胞競爭，降低機(jī)體產(chǎn)生特異性蛋白A抗體，導(dǎo)致病原菌在人體的感染及復(fù)發(fā)。因而 研究一種與IgG結(jié)合力較弱的蛋白A衍生物，對(duì)于金葡菌疫苗的開發(fā)具重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種與IgG結(jié)合力較弱的蛋白A衍生物及其用途。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含上述蛋白A衍生物的融合蛋白。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種葡萄球菌A蛋白的Z結(jié)構(gòu)域衍生物，其具有結(jié)合 IgG的能力，其中：
[0007] (1)所述Z結(jié)構(gòu)域衍生物由Z結(jié)構(gòu)域的氨基酸突變所形成；
[000引 似氏"化《10%，其中Kz"為所述Z結(jié)構(gòu)域衍生物與IgG的結(jié)合常數(shù)，Kz為Z結(jié) 構(gòu)域與IgG的結(jié)合常數(shù)；和
[0009] (3)使用所述Z結(jié)構(gòu)域衍生物免疫動(dòng)物后可誘發(fā)所述動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)葡萄球菌A蛋 白的免疫反應(yīng)。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述Kzfy/Kz《1%，較佳地《0.1%，更佳地《0.01%。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述Z結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述Z結(jié)構(gòu)域中突變的氨基酸數(shù)目為1-10個(gè)，較佳地為1-5個(gè)， 更佳地為1-3個(gè)。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述突變發(fā)生在Z結(jié)構(gòu)域的第13位Phe和/或第14位Tyr。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述Z結(jié)構(gòu)域的第13位Phe突變?yōu)镚ly和/或第14位Tyr突 變?yōu)镚ly。
[001引在另一優(yōu)選例中，所述Z結(jié)構(gòu)域衍生物的氨基酸序列如SEQIDNO. :2所示。
[0016] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白是如本發(fā)明第一方面所 述的Z結(jié)構(gòu)域衍生物與載體蛋白融合所形成的，并且所述融合蛋白能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì) 葡萄球菌A蛋白的免疫反應(yīng)。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白具有至少一個(gè)T細(xì)胞表位，并且在所述載體蛋白 的至少一個(gè)分子表面氨基酸殘基區(qū)通過拼接、替換、和/或插入而引入所述的Z結(jié)構(gòu)域衍生 物。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白與所述抗原膚段不是來自同一個(gè)蛋白，并且所述 載體蛋白可W增強(qiáng)所述表位膚的免疫原性。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜結(jié)構(gòu)域DTT、霍 亂毒素B亞單位（CTB)、沙口氏菌鞭毛蛋白（Flic)、百日咳毒素（PTX)、破傷風(fēng)毒素、或上述 蛋白的免疫原性片段（如破傷風(fēng)毒素的C片段）、輪狀病毒VP7、利什曼原蟲的熱休克蛋白、 空腸彎曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原體主要外膜蛋白、血藍(lán)蛋白化巧holeLimpet化mo巧anin, KLH)、牛血清白蛋白度ovineSe;rumA化umin，BSA)，雞卵白蛋白（Ova化umin，OVA)，纖維蛋 白原。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述"分子表面氨基酸殘基區(qū)"包括loop區(qū)、beta-tum區(qū)、N末 端或C末端。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白為DTT。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述Z結(jié)構(gòu)域衍生物連接于所述載體蛋白的C末端和/或N末 端形成所述融合蛋白。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述Z結(jié)構(gòu)域衍生物和所述載體蛋白之間具有連接膚；優(yōu)選地， 所述連接膚長度為3-30個(gè)氨基酸；更優(yōu)選地，所述連接膚長度為4-20個(gè)氨基酸；最優(yōu)選 地，所述連接膚長度為7-17個(gè)氨基酸。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述Z結(jié)構(gòu)域衍生物和所述載體蛋白之間不具有連接膚。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白選自：
[002引 （a)具有SEQIDNO. : 20或21所示氨基酸序列的多膚；
[0027] 化）將（a)中多膚經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具 有誘發(fā)免疫反應(yīng)功能的由（a)衍生的多膚。
[0028] 本發(fā)明的第H方面，提供了一種多核巧酸，所述的多核巧酸編碼本發(fā)明第一方面 所述的Z結(jié)構(gòu)域衍生物或本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白。
[0029] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明第H方面所 述的多核巧酸。
[0030] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第四方面 所述的表達(dá)載體，或者在基因組中整合有本發(fā)明第H方面所述的所述的多核巧酸。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、酵母、010細(xì)胞、DC細(xì)胞等。
[0033] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有本發(fā)明第一方面 所述的Z結(jié)構(gòu)域衍生物、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第H方面所述的多核巧 酸、本發(fā)明第四方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞，W及藥學(xué)上可 接受的載體和/或輔料。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為疫苗。
[0035] 本發(fā)明的第走方面，提供了一種疫苗組合物，所述的組合物含有本發(fā)明第一方面 所述的Z結(jié)構(gòu)域衍生物、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第H方面所述的多核巧 酸、本發(fā)明第四方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞，W及免疫學(xué)上 可接受的載體和/或輔料。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的疫苗組合物還含有佐劑。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的佐劑包括氧化鉛、皂巧、quilA、胞壁醜二膚、礦物油或 植物油、基于囊泡的佐劑、非離子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、細(xì)胞因子（包括IL-1、IL-2、 IFN-r、GM-CSF、比-6、比-12、和CpG)。
[0038] 本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的Z結(jié)構(gòu)域衍生物、本發(fā)明第二 方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第H方面所述的多核巧酸、本發(fā)明第四方面所述的表達(dá)載體 或者本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞的用途，
[0039] (a)用于制備針對(duì)葡萄球菌蛋白A的抗體；和/或化）用于制備治療與葡萄球菌 感染相關(guān)的疾病的藥物。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的疾病包括；金黃色葡萄球菌感染所導(dǎo)致的人類化賊性感 染、皮膚和軟組織感染、壞死性肺炎、賊毒癥、菌血癥、骨髓炎和必內(nèi)膜炎等疾病等。
[0041] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療方法，給需要的對(duì)象施用本發(fā)明第一方面所 述的Z結(jié)構(gòu)域衍生物、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第H方面所述的多核巧酸、 本發(fā)明第四方面所述的表達(dá)載體本發(fā)明第六方面所述的所述的藥物組合物或本發(fā)明第走 方面所述的疫苗組合物。
[0042] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[004引圖1顯示了人IgG與Z、ZFY蛋白反應(yīng)的等溫量熱滴定量曲線。
[0044]圖2顯示了小鼠抗血清效價(jià)測定結(jié)果。
[004引 圖3顯示了Elisa檢測對(duì)照組F(油'）2與特異性F(油'）2與SPA結(jié)合的性能。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)將與IgG結(jié)合力較強(qiáng)的Z結(jié)構(gòu)域中 第13、14位的化e、Tyr兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基均突變?yōu)镚ly，即ZFY衍生物，可使ZFY與IgG結(jié)合能降低到-61.68kcal/mol，僅為原相互作用力的10. 69%，并通過PCR突變技術(shù)構(gòu)建了 ZFY蛋白表達(dá)體系。同時(shí)將ZFY衍生物和載體蛋白DTT偶聯(lián)，得到了一種方便表達(dá)純化的蛋 白，該蛋白可有效激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生蛋白A抗體。
[0047] 本發(fā)明提供了可有效激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生蛋白A抗體的融合蛋白及其應(yīng)用。所述融 合蛋白包括葡萄球菌A蛋白的Z結(jié)構(gòu)衍生物，所述Z結(jié)構(gòu)衍生物具有；（1)由Z結(jié)構(gòu)域的氨 基酸突變所形成；（2)Kz"/Kz《10%，其中Kz"為所述Z結(jié)構(gòu)域衍生物與IgG的結(jié)合常數(shù)，Kz 為Z結(jié)構(gòu)域與與IgG的結(jié)合常數(shù)；和（3)免疫動(dòng)物后可誘發(fā)所述動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)葡萄球菌A 蛋白的免疫反應(yīng)。
[0048] 本發(fā)明的另一目的是提供由包含該融合蛋白的組合物組成的疫苗，所述的組合物 含有本發(fā)明所述的Z結(jié)構(gòu)域衍生物、融合蛋白、多核巧酸、表達(dá)載體或者宿主細(xì)胞，W及免 疫學(xué)上可接受的載體和/或輔料。
[0049] 本發(fā)明的另一目的是提供一種治療疾病的方法，尤其用于葡萄球菌引起的疾病。 該方法是通過向患有由葡萄球菌感染引起的疾病的患者給予由包含本發(fā)明的融合蛋白的 組合物組成的疫苗，所述疾病選自下組：人類化賊性感染、皮膚和軟組織感染、壞死性肺炎、 賊毒癥、菌血癥、骨髓炎和必內(nèi)膜炎等。
[0050] 蛋白A結(jié)構(gòu)域Z氨基酸序列為：
[005U VDNKFNKEQQNA四EILHLP化TEEQRAAFIQSL邸DPSQSAELLAEAKKLNDAQAPK(SEQID NO. : 1)
[005引ZFY衍生物氨基酸序列為：
[005引VDNKFNKEQQNA雄EILHLP化TEEQRAAFIQSL邸DPSQSAELLAEAKKLNDAQAPK(SEQID NO. :2)
[0054] 通過PCR突變技術(shù)，將Z結(jié)構(gòu)域中第13、14位的化e、Tyr均突變?yōu)镚ly，即得ZFY 衍生物。
[00財(cái)載體蛋白
[0056] 如本文所用，術(shù)語"載體蛋白"指在本發(fā)明的重組蛋白中作為蛋白結(jié)構(gòu)骨架的蛋 白。通常，所述的載體蛋白是免疫原性較強(qiáng)的蛋白，例如病原體蛋白，代表性的例子包括 (但并不限于）；病毒蛋白、細(xì)菌蛋白、衣原體蛋白、支原體蛋白等。
[0057] 如本文所用，術(shù)語"Z結(jié)構(gòu)域衍生物（膚）"指擬誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)的其它蛋白 的一段膚，該表位相對(duì)于載體蛋白而言的不是指載體蛋白本身能夠引起免疫反應(yīng)的膚段。 通常，Z結(jié)構(gòu)域衍生物指免疫反應(yīng)擬祀向的膚段，較佳地來源于哺乳動(dòng)物（如人）蛋白的一 段膚，而不是來自所述載體蛋白。
[0058] 如本文所用，術(shù)語.P化專指蛋白質(zhì)；級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件，來自Protein化ta B曰nk(WWW.pdb.org)；
[0059] 如本文所用，術(shù)語DTT指白喉毒素的跨膜結(jié)構(gòu)域；
[0060] 如本文所用，術(shù)語T細(xì)胞表位又稱為T細(xì)胞Z結(jié)構(gòu)域衍生物，是抗原分子經(jīng)過抗原 呈遞細(xì)胞中酶解加工產(chǎn)生的一段