1，T0X5-B0RP巧
[0130]GLPTHLYKNFTV犯LALKLKGKNQ邸化TAFMSGRSLVRA化SDAG肥皿TW抑TMLGFA
[0131]ISAYALKSRIALTVEDSPYPGTPGDLLELQICPLNGYCE(SEQIDNO. : 12)
[0132]6.破傷風毒素（Tetanustoxin,TT)
[0133]TT毒性極強，由破傷風桿菌產(chǎn)生是由一條約150kD的單一多膚鏈構(gòu)成的，可被切 成兩條由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈，重鏈則包含兩個50Dk的結(jié)構(gòu)域，N末端是遷移結(jié)構(gòu) 域，在脂質(zhì)雙分子層中形成離子通道；重鏈的C末端是神經(jīng)節(jié)巧脂結(jié)構(gòu)域，又稱為C片段 (TThC)，在與祀細胞膜結(jié)合及毒素分子進入類膽堿神經(jīng)元的過程中起著十分重要的作用。 TT重鏈（TTh)是本發(fā)明優(yōu)選的表位疫苗載體。
[0134]TTh氨基酸序列（1YYN.P化）如下所示：
[0135]邸IDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSV口YPDA化VPGINGKAIHLVNNESSEVI
[0136]VHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTOEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVS
[01；37] LKGNNLIWl'L邸SAGEVRQITF畑。DKFNAYLANKWVFIUTND化SSANLYINGVLMG
[0138]SAEITGLGAIR邸順mJ(LDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNP邸IEKLYTSYLS口化
[0139]畑FWGNPLRYDTEYYLIPVASSS邸VQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLK
[0140]巧化RYTPNNEIDSFVKSGD巧KLYVSY順肥HIVGYP邸GNAFNNLDRILRVGYNAPGI
[0141]PLYKKMEAVKL畑LKTYSVQLKLY孤KNASLGLVGTHNGQIGNDPN畑ILlASNWYFNHL
[0142]邸KILGCDWYFVPTDEGWTND(SEQIDNO. : 13)
[0143] 融合蛋白
[0144] 如本文所用，術(shù)語"融合蛋白"，指本發(fā)明所述的Z結(jié)構(gòu)域衍生物與載體蛋白融合 所形成的，并且所述融合蛋白能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生針對葡萄球菌A蛋白的免疫反應(yīng)的重組蛋 白。此外，所述術(shù)語還包括能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生針對葡萄球菌A蛋白的免疫反應(yīng)的、SEQID NO;2序列的變異形式。送些變異形式包括（但并不限于）；1-3個（通常為1-2個，更佳地 1個）氨基酸的缺失、插入和/或取代，W及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個 (通常為3個W內(nèi)，較佳地為2個W內(nèi)，更佳地為1個W內(nèi)）氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用 性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/ 或N末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。此外，所述 術(shù)語還包括單體和多聚體形式的本發(fā)明多膚。該術(shù)語還包括線性W及非線性的多膚（如環(huán) 膚）。
[0145] 組合物和施用方法
[0146] 本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有；（i)本發(fā)明的重組蛋白或本發(fā)明的可編碼 重組蛋白的多核巧酸，W及（ii)藥學上或免疫學上可接受的賦形劑或佐劑。
[0147] 本發(fā)明中，術(shù)語"含有"表示各種成分可一起應(yīng)用于或存在于本發(fā)明的組合物中。 因此，術(shù)語"主要由...組成"和"由...組成"包含在術(shù)語"含有"中。
[014引本發(fā)明的組合物包括藥物組合物和疫苗組合物。
[0149] 本發(fā)明的組合物可W是單價的（僅含有一種重組蛋白或多核巧酸），也可W是多 價的（含有多種重組蛋白或多核巧酸）。
[0150] 本發(fā)明的藥物組合物或疫苗組合物可制備成各種常規(guī)劑型，其中包括（但并不限 于）；注射劑、粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、噴霧劑等。
[0151] (1)藥物組合物
[0152] 本發(fā)明的藥物組合物包含（或含有）治療有效量的本發(fā)明重組蛋白或多核巧酸。
[0153] 本文所用的術(shù)語"治療有效量"指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量， 或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預防效果的量。該效果可通過例如抗原水平來檢測。治療效果 也包括生理性癥狀的減少。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、 病癥的性質(zhì)和程度、W及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有 效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可W用常規(guī)實驗來確定該有效量。
[0154] 為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個體約0. 001毫克/千克至1000毫克/千 克，較佳地約0.01毫克/千克至100毫克/千克體重的重組蛋白。
[0155]藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體。術(shù)語"藥學上可接受的載體"指用于治 療劑（例如本發(fā)明的重組蛋白）給藥的載體。該術(shù)語指送樣一些藥劑載體：它們本身不誘 導產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。合適的載體可W是 大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸（polylacticacid)、聚己醇酸等。送些載 體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington's化armaceuticalSciences(Mack化b. Co.，N.J. 1991)中可找到關(guān)于藥學上可接受的載體或賦形劑的充分討論。
[0156] 組合物中藥學上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和己醇。另外，送些載 體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、抑緩沖物質(zhì)等。通常，可將組合物制成 可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的的 固體形式。脂質(zhì)體也包括在藥學上可接受的載體的定義中。
[0157] (ii)疫苗組合物
[015引本發(fā)明的疫苗（組合物）可W是預防性的（即預防疾?。┗蛑委熜缘模丛诨疾?后治療疾?。?。
[0159] 送些疫苗包含免疫性抗原（包括本發(fā)明重組蛋白），并且通常與"藥學上可接受的 載體"組合，送些載體包括本身不誘導產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。 合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚己醇酸、氨基酸聚 合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物（如油滴或脂質(zhì)體）等。送些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 所熟知的。另外，送些載體可起免疫刺激劑（"佐劑"）作用。另外，抗原也可W和細菌類毒 素（如白喉、破傷風、霍亂、幽口螺桿菌等病原體的類毒素）偶聯(lián)。
[0160] 增強免疫組合物效果的優(yōu)選佐劑包括但不限于；（1)鉛鹽（alum)，如氨氧化鉛、磯 酸鉛、硫酸鉛等；（2)水包油型乳劑配方，例如，（a)MF59(參見W0 90/14837)，化)SAF，和（C) 化biTM佐劑系統(tǒng)（RA巧巧ibiImmunochem，Hamilton，MT)，（3)皂素佐劑；（4)化eund完全佐 劑（CFA)和化eund不完全佐劑（IFA) ;(5)細胞因子，如白介素（如比-1、比-2、比-4、比-5、 比-6、IL-7、IL-12等）、干擾素（如Y干擾素）、巨瞻細胞集落刺激因子（M-CF巧、腫瘤壞 死因子（TN巧等；（6)細菌ADP-核糖基化毒素（如大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素LT)的脫毒變異 體；W及（7)作為免疫刺激劑來增強組合物效果的其它物質(zhì)。
[0161] 包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗組合物（例如，可包括抗原、藥學上可接受的載 體W及佐劑），通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，己醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳 化劑、抑緩沖物質(zhì)等可存在于送類運載體中。
[0162] 更具體地，包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗，包含免疫學有效量的免疫原性多膚， W及上述其它所需的組分。"免疫學有效量"指W單劑或連續(xù)劑一部分給予個體的量對治 療或預防是有效的。該用量可根據(jù)所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別 (如人）、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療狀 況的評估、及其它的相關(guān)因素而定。預計該用量將在相對較寬的范圍內(nèi)，可通過常規(guī)實驗來 確定。
[0163] 通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還 可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在 脂質(zhì)體中，W增強佐劑效果。
[0164] 此外，本發(fā)明的疫苗組合物可W是單價的或多價疫苗。
[0165] (iii)給藥途徑和劑量
[0166] 一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待治療的對象可W是哺乳動物， 尤其是人。
[0167]當用作疫苗時，可用已知的方法將本發(fā)明的重組蛋白直接施用于個體。通常采用 與常規(guī)疫苗相同的施用途徑和/或模擬病原體感染路徑施用送些疫苗。
[0168] 給予本發(fā)明藥物組合物或疫苗組合物的途徑包括（但并不限于）；肌內(nèi)、皮下、皮 內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)口服或其它腸胃外給藥途徑。如果需要，可w組合給藥途徑，或根 據(jù)疾病情況進行調(diào)節(jié)。疫苗組合物可W單劑量或多劑量給予，且可W包括給予加強劑量W 引發(fā)和/或維持免疫力。
[0169] 應(yīng)有效量"給予重組蛋白疫苗，即重組蛋白的量在所選用的給藥路徑中足W引 發(fā)免疫應(yīng)答，能有效促使保護宿主抵抗相關(guān)的疾病。
[0170] 代表性的疾病包括（但并不限于）：自身免疫性疾病、腫瘤等。
[0171] 在各疫苗劑份中所選用的重組蛋白的量，是按可引發(fā)免疫保護性應(yīng)答而無明顯的 副作用的量而定。通常，在感染宿主細胞后，各劑的疫苗足W含有約1yg-lOOOmg，較佳地為 1yg-lOOmg，更佳地10yg-50mg蛋白質(zhì)。可用包括觀察對象中的抗體滴定度和其它反應(yīng)的 標準研究方法來確定具體疫苗的最佳用量?？赏ㄟ^監(jiān)控疫苗提供的免疫力水平來確定是否 需要增強劑量。在評估了血清中的抗體滴定度后，可能需要選用增強劑量免疫接種。施用 佐劑和/或免疫刺激劑就可提高對本發(fā)明的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
[0172] 優(yōu)選方法是從腸胃外（皮下或肌內(nèi)）途徑通過注射給予免疫原性組合物。
[0173] 此外，本發(fā)明的疫苗可W結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予，或者與其他治療劑一起 給予。
[0174] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[01巧](1)本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)了一種蛋白AZ結(jié)構(gòu)域的衍生物ZEY，該衍生物與IgG的結(jié) 合力適中，用作疫苗可有效激發(fā)機體產(chǎn)生針對蛋白A的免疫反應(yīng)，實驗證明，ZFY免疫組所 得到的抗血清的效價可W高出天然蛋白A直接免疫所得到的抗血清的效價一到兩個數(shù)量 級。
[0176] (2)將ZEY與DTT載體融合制備的融合蛋白，DTT-ZFY免疫組所得到的抗血清的效 價可W高出天然蛋白A直接免疫所得到的抗血清效價兩到H個數(shù)量級。
[0177] (3)本發(fā)明的ZEY和DTT-ZFY重組蛋白的制備成本低，給藥方便。
[0178] (4)相對于與載體蛋白化學偶聯(lián)的制劑，本發(fā)明的融合蛋白抗原結(jié)構(gòu)確切、質(zhì)量可 控，更安全。
[0179] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，送些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件如Sambrook等人，分子克??；實驗室手冊（New化rk:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。
[0180] 實施例1蛋白載體的構(gòu)建
[0181] 根據(jù)GeneBank中sumo基因（小分子泛素樣修飾蛋白，作為重組蛋白表達的融合 標簽）、DT的T結(jié)構(gòu)域基因mRNA和蛋白A基因mRNA的開放閱讀框的序列，設(shè)計引物通過重 疊PCR的原理在sumo基因后，連接DT的T結(jié)構(gòu)域，然后再引入蛋白A的其中一個結(jié)構(gòu)域Z， 并將結(jié)構(gòu)域Z中引入兩個突變，F(xiàn)13G/Y14G，并在頭尾引入酶切位點Ndel和BamHI，并引入 保護堿基，連入PET28。根據(jù)引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。本發(fā)明的具體設(shè) 計的sumo-DTT-ZFY的膚鏈氨基酸序列如下沈QIDNO: 7所示；其DNA序列如SEQIDNO:8所 示；并且設(shè)計并合成引物如下；P1;SEQIDNO: 14 ;P2;SEQIDNO: 15 ;P3;SEQIDNO: 16 ;P4 : SEQI