使用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生單性生殖干細(xì)胞和患者特異性人胚胎干細(xì)胞的制作方法
【專利說明】使用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生單性生殖干細(xì)胞和患者特異性人胚 胎干細(xì)胞
[0001] 其它申請的交叉引用
[0002] 本申請依據(jù)35 U. S. C. § 119 (e)包括美國臨時專利申請No. 61/765, 548和 61/765, 563的優(yōu)先權(quán)要求，每一專利申請在2013年2月15日提出。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及免疫相容性多潛能干細(xì)胞（pSC)，包括患者特異性pSC。本文中描述的 方法涉及單性生殖或核轉(zhuǎn)移且通過這些技術(shù)產(chǎn)生的免疫相容性PSC的組合物廣泛應(yīng)用于 再生醫(yī)學(xué)療法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 人多潛能干細(xì)胞（hPSC)具有在體內(nèi)分化成實際上所有體細(xì)胞類型的顯著能力 (多潛能性），同時維持呈未分化狀態(tài)的增殖能力（自我更新）。hPSC的這些獨特特征 提供了產(chǎn)生可移植的細(xì)胞和組織材料以用于治療在尤其糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎和帕金森氏病 (Parkinson's disease)范圍內(nèi)的疾病和病狀的機會。因為許多人損傷和疾病是由包括單 一細(xì)胞類型的細(xì)胞缺陷在內(nèi)的細(xì)胞缺陷引起，所以用適當(dāng)干細(xì)胞、祖細(xì)胞或體外分化細(xì)胞 替換可以在臨床中產(chǎn)生新穎的治療方法。此外，雖然活的供體、尸體或胎兒來源已經(jīng)用作移 植材料的來源，但多潛能干細(xì)胞的自我更新能力進(jìn)一步提供了可移植材料的幾乎無限的資 源。另一個益處是hPSC可以用患者特異性的方式產(chǎn)生，由此產(chǎn)生了降低免疫排斥風(fēng)險和耐 受性的治療方法。因此，對包括免疫相容性hPSCS和患者特異性hPSC在內(nèi)的再生細(xì)胞移植 相當(dāng)?shù)目駸帷?br>[0006] -種產(chǎn)生免疫相容性hPSC的策略是促進(jìn)從卵母細(xì)胞的單性生殖（即無性生殖） 以產(chǎn)生用于hPSC分離的胚泡。簡單地說，此方法依賴于人工誘發(fā)卵母細(xì)胞以在缺乏精子受 精的情況下進(jìn)行減數(shù)分裂和有絲分裂過程，產(chǎn)生二倍體（2個母系基因組）單性生殖體，其 可以進(jìn)一步培養(yǎng)成胚泡，從胚泡可以分離出hPSC。使用該單性生殖方法，分離的hPSC被稱 為單性生殖體衍生的人多潛能干細(xì)胞（pn-hPSC)。
[0007] -種替代的方法允許通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移（SCNT)產(chǎn)生患者特異性hPSC。體細(xì)胞核 轉(zhuǎn)移涉及供體患者的體細(xì)胞的核分離和插入到去核的接受者卵母細(xì)胞中。供體核轉(zhuǎn)移到接 受者卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)通過使體細(xì)胞基因沉默和活化胚胎基因，引起所轉(zhuǎn)移的供體核進(jìn)行 程序重排。從重構(gòu)的卵母細(xì)胞，可以建立培養(yǎng)的胚泡以從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM)分離hPSC。作為 核轉(zhuǎn)移的結(jié)果，hPSC(NT-hPSC)攜帶著患者特異性的患者的核遺傳物質(zhì)。技術(shù)程序相關(guān)的 兩個技術(shù)存在顯著的重疊。舉例來說，早期嘗試實現(xiàn)NT-hPSC細(xì)胞系產(chǎn)生了 pn-hPSC細(xì)胞 系產(chǎn)生的意外并首先知道的情況。
[0008] 盡管單性生殖和SCNT技術(shù)的發(fā)展有前景，但目前存在排除切實可行的臨床應(yīng)用 的顯著限制。舉例來說，已存在的單性生殖研究已經(jīng)報導(dǎo)了在大概50%的供體卵母細(xì)胞中 的成功卵母細(xì)胞活化，但一個關(guān)鍵的限制似乎是誘發(fā)胚泡的形成，其可能下降至低到15% 或更少的活化卵母細(xì)胞。因為與核轉(zhuǎn)移相關(guān)，所以使用常規(guī)技術(shù)，僅僅至多低至2%的重構(gòu) 卵母細(xì)胞越過達(dá)至胚泡形成的8細(xì)胞臨限?？傊?，這些限制可能意味著小于10%的供體卵 母細(xì)胞被成功地培養(yǎng)成pn-hPSC。隨后的pn-hPSC可能具有其它不希望有的屬性，比如非整 倍性或核型不穩(wěn)定性。
[0009] 由于目前不清楚允許一致和可再生的卵母細(xì)胞活化和胚泡形成的確切機制，所以 當(dāng)然，對這些過程的更透徹了解將有助于目前限制PSC譜系產(chǎn)生的障礙。
[0010] 舉例來說，在單性生殖中減數(shù)分裂期期間發(fā)生的重組事件可以產(chǎn)生可變量的接合 性。因此，實時目測這些事件不僅僅提高了胚泡形成和pn-hPSC細(xì)胞系產(chǎn)生的成功率，而 且還有助于旨在實現(xiàn)所得pn-hPSC細(xì)胞的特異性遺傳和免疫特征的操縱策略。類似地，當(dāng) 前用于獲得NT-hPSC的SCNT方法使用來自體外受精臨床的卵母細(xì)胞。同樣由非整倍性、核 型不穩(wěn)定性和/或低效率的核程序重排引起的高失敗率需要更大量的卵母細(xì)胞用于衍生 NT-hPSC，且仍然局限于產(chǎn)生非患者特異性的細(xì)胞。因此，本領(lǐng)域中非常需要允許使用SCNT 和/或單性生殖技術(shù)，一致、有效地產(chǎn)生免疫相容性和患者特異性hPSC的技術(shù)。
[0011] 本文中描述了用于建立免疫相容性和/或患者特異性hPSC的技術(shù)。在一個方面， 描述了使用改良的技術(shù)的有效SCNT和/或單性生殖。此包括改善顯微操作以減少細(xì)胞破 壞；在不使用苛刻著色劑和/或紫外線暴露下用于實時目測的偏光顯微術(shù)。更重要地，已 經(jīng)通過應(yīng)用甲基化改變劑消除了與有效胚泡產(chǎn)生有關(guān)的關(guān)鍵屏障，所述甲基化改變劑促進(jìn) 了重構(gòu)的卵母細(xì)胞內(nèi)基因組的活化，以及有絲分裂結(jié)構(gòu)（例如中心粒）從精子衍生物添 加以促進(jìn)胚泡擴張。應(yīng)用這些改良的技術(shù)允許實現(xiàn)表達(dá)共同人白細(xì)胞抗原（HLA)單倍體 的pn-hPSC庫，從而提供了免疫學(xué)上與寬群體部分相容的細(xì)胞。在所有方面，pn-hPSC和 NT-hPSC可以在無動物蛋白的培養(yǎng)基上生長，對于最終涉及人患者的臨床應(yīng)用為重要的，并 提供遺傳學(xué)上和表觀遺傳學(xué)上穩(wěn)定和多潛能的可移植細(xì)胞。 發(fā)明概要
[0012] 本文中描述了一種產(chǎn)生單性生殖體衍生的人多潛能干細(xì)胞系（pn-hPSC)的方法， 其包括通過在活化培養(yǎng)基中培育來活化卵母細(xì)胞，通過在后活化培養(yǎng)基中培育所述活化 的卵母細(xì)胞產(chǎn)生單性生殖體，通過在培養(yǎng)基中培育所述單性生殖體形成胚泡，并從所述胚 泡分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM)細(xì)胞，其中所述ICM細(xì)胞能夠進(jìn)一步培養(yǎng)為pn-hPSC細(xì)胞系。在 其它實施方案中，所述活化培養(yǎng)基包括鈣離子載體。在其它實施方案中，所述鈣離子載體 包括伊屋諾霉素（ionomycin)、A23187、白僵菌毒素（beauvericin)、X-537A和/或燕麥 曲菌素（avenaciolide)。在其它實施方案中，所述后活化培養(yǎng)基包括6-DMAP、嘌呤霉素 (puromycin)、乙醇、放線菌酮（cycloheximide，CHX)、曲古霉素 A(trichostatin A，TSA)和 /或細(xì)胞分裂抑素 B(cyt〇Chalasin B，CB)。在其它實施方案中，所述后活化培養(yǎng)基包括不 阻止第二極體排出的化合物。在其它實施方案中，卵母細(xì)胞包括中期II(MII)期卵母細(xì)胞。 在其它實施方案中，卵母細(xì)胞包括中期I(MI)期卵母細(xì)胞。在其它實施方案中，卵母細(xì)胞包 括單一原核卵母細(xì)胞。在其它實施方案中，pn-hPSC細(xì)胞系是雜合的。在其它實施方案中， pn-hPSC細(xì)胞系是純合的。在其它實施方案中，pn-hPSC細(xì)胞系包括具有與至少1 %的群體 免疫相容的人白細(xì)胞抗原（HLA)單倍體。在其它實施方案中，HLA單倍體包括HLA-A、HLA-B 和HLA-DR。在其它實施方案中，所述方法包括注射精子因子至卵母細(xì)胞。在其它實施方案 中，卵母細(xì)胞是在CARM 1和/或Esrrb存在下培育。
[0013] 本文中進(jìn)一步描述了一種單性生殖體衍生的人多潛能干細(xì)胞系（pn-hPSC)，其包 括從單性生殖體衍生的胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM)細(xì)胞分離的多潛能細(xì)胞。在其它實施方案 中，單性生殖體衍生的胚泡包括通過在活化培養(yǎng)基中培育卵母細(xì)胞所產(chǎn)生的單性生殖體。 在其它實施方案中，所述活化培養(yǎng)基包括鈣離子載體。在其它實施方案中，所述鈣離子載體 包括伊屋諾霉素、A23187、白僵菌毒素、X-537A和/或燕麥曲菌素。在其它實施方案中，單性 生殖體衍生的胚泡包括通過在后活化培養(yǎng)基中培育活化的卵母細(xì)胞產(chǎn)生單性生殖體。在其 它實施方案中，所述后活化培養(yǎng)基包括6-DMAP、嘌呤霉素、乙醇、放線菌酮（CHX)、曲古霉素 A(TSA)和/或細(xì)胞分裂抑素 B (CB)。在其它實施方案中，pn-hPSC細(xì)胞系是雜合的。在其它 實施方案中，pn-hPSC細(xì)胞系是純合的。在其它實施方案中，pn-hPSC細(xì)胞系包括具有與至 少1%的群體免疫相容的人白細(xì)胞抗原（HLA)單倍體的多潛能細(xì)胞。在其它實施方案中，多 潛能細(xì)胞表達(dá)來自包括以下的組的一種或多種標(biāo)記物：階段特異性胚胎抗原-4 (SSEA-4)、 SSEA-3、腫瘤排斥抗原1-81 (Tra-1-81)、Tra-1-60、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4(0ct-4)、性別 決定區(qū) Y-box-2 (Sox-2)、nanog、鋅指蛋白-42 (Rex-l/Zfp-42)、lefty A、畸胎癌衍生生長因 子（Tdgf)和端粒重復(fù)序列結(jié)合因子（Terf-I)。在其它實施方案中，多潛能細(xì)胞能夠分化成 來源于內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的細(xì)胞。在其它實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括注射精子 因子至卵母細(xì)胞。在其它實施方案中，卵母細(xì)胞是在CARM 1和/或Esrrb存在下培育。本 文中還描述了包括所述pn-hPSC細(xì)胞系中的一或多者的單性生殖體衍生的人多潛能干細(xì) 胞系（pn-hPSC)的庫。
[0014] 本文中還描述了一種產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移人多潛能干細(xì)胞系（NT-hPSC)的方法，其包括通 過添加至少一個供體細(xì)胞的至少一個核來去除卵母細(xì)胞的核，產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移（NT)卵母細(xì)胞， 通過在活化培養(yǎng)基中培育來活化NT卵母細(xì)胞，從活化的NT卵母細(xì)胞產(chǎn)生胚泡，并從胚泡分 離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM)細(xì)胞，其中ICM細(xì)胞能夠進(jìn)一步培養(yǎng)為NT-hPSC細(xì)胞系。在其它實施方案 中，所述方法包括添加至少一個供體細(xì)胞的至少一個核包括直接注射。在其它實施方案中， 所述方法包括添加至少一個供體細(xì)胞的至少一個核包括體細(xì)胞融合。在其它實施方案中， 體細(xì)胞融合包括使仙臺病毒（Sendai virus)、蛋白質(zhì)或其提取物接觸所述至少一個供體細(xì) 胞。在其它實施方案中，所述至少一個供體細(xì)胞包括體細(xì)胞或生殖細(xì)胞。在其它實施方案 中，所述方法是在缺乏紫外光下進(jìn)行。在其它實施方案中，所述方法包括注射精子因子至卵 母細(xì)胞。在其它實施方案中，卵母細(xì)胞是在CARM 1和/或Esrrb存在下培育。文中還本描 述了一種通過所述方法產(chǎn)生的NT-hPSC細(xì)胞系，所述方法包括通過添加至少一個供體細(xì)胞 的至少一個核去除卵母細(xì)胞的核，產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移（NT)卵母細(xì)胞，通過在活化培養(yǎng)基中培育來 活化NT卵母細(xì)胞，從活化的NT卵母細(xì)胞產(chǎn)生胚泡，并從胚泡分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM)細(xì)胞，其 中ICM細(xì)胞能夠進(jìn)一步培養(yǎng)為NT-hPSC細(xì)胞系。
[0015] 本文中還描述了一種核轉(zhuǎn)移的方法，其包括通過添加至少一個供體細(xì)胞的至少一 個核至卵母細(xì)胞并去除卵母細(xì)胞的主體核來產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移（NT)卵母細(xì)胞。在其它實施方案 中，所述方法包括通過在活化培養(yǎng)基中培育來活化NT卵母細(xì)胞，從活化的NT卵母細(xì)胞產(chǎn)生 胚泡，并從胚泡分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM)細(xì)胞，其中ICM細(xì)胞能夠進(jìn)一步培養(yǎng)為NT-hPSC細(xì)胞 系。在其它實施方案中，所述方法包括注射精子因子至卵母細(xì)胞。在其它實施方案中，卵母 細(xì)胞是在CARM 1和/或Esrrb存在下培育。
[0016] 附圖簡述
[0017] 參考圖中說明例示性實施方案。意圖本文公開的實施方案和圖視為例示性的而非 限制性的。
[0018] 圖1.卵母細(xì)胞的去核。"刀型吸液管"的輪廓允許在尖端抵著（B)通過保持吸移 管來保持穩(wěn)定的細(xì)胞的側(cè)邊前進(jìn)時，經(jīng)由（A)實心尖銳的精細(xì)尖端有效刺穿透明帶。（C)刺 穿之后，經(jīng)由圓形牽引的珠粒末端操縱卵母細(xì)胞以"修剪"裂縫和（D)極體定位于裂縫邊緣 附近。在較大的中空管體為使用者提供整體結(jié)構(gòu)以更容易地抓住刀型吸移管下，（E)定位 于裂縫附近的極體接著可以（F)擠出以供提取。
[0019] 圖2. NT-PSC的衍生。（A)體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移胚泡，⑶透明帶去除后的涂鋪的胚胎， (C) NT-胚胎的初始長出，（D) 3次傳代后形成的胚細(xì)胞樣群落。
[0020] 發(fā)明詳述
[0021] 本文中引用的所有參考文獻(xiàn)均如同完全闡述一般以引用的方式整體并入本文 中。除非另外定義，否則本文中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的技術(shù)人 員通常所了解的含義相同的含義。Alien等人，Remington:The Science and Practice of Pharmacy 第 22 版·，Pharmaceutical Press (2〇l2 年 9 月 I5 日）；Hornyak 等 人，Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008) ；Singleton 和 Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第 3 版，修訂 版，J.Wiley&Sons(New York, NY 2006) ;Smith，March' s Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure 第 7 版，J.Wiley&Sons (New York, NY 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 第 3 版，Wiley-Blackwell(2012 年 11 月 28 日）；以及 Green 和 Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第 4 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor, NY 2012)為 本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供了對本申請中使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。關(guān)于如何制備抗 體，參見 Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 第 2 版，Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013) ; 和 Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,Eur. J. Tmmunol · 1976年7月，6(7) :511-9 ; Queen 和 Se lick, Humanized immunoglobulins,美國 專利 No. 5, 585, 089(1996 年 12 月）；以及 Riechmann 等人，Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 年 3 月 24 日，332(6162):323-7。
[0022] 熟習(xí)此項技術(shù)者將認(rèn)識到與本文所描述的方法和材料類似或同等的許多方法和 材料，其可用于實施本發(fā)明。實際上，本發(fā)明決不限于本文中描述的方法。出于本發(fā)明的目 的，下文定義以下術(shù)語。
[0023] 如本文所用，"施用（Administering) "和/或"施用（administer) "是指用于傳 遞藥物組合物至患者的任何途徑。傳遞途徑可以包括非侵襲性經(jīng)口（通過口腔）、局部（皮 膚）、經(jīng)粘膜（鼻、頰/舌下、陰道、眼睛和直腸）和吸入途徑以及不經(jīng)腸途徑和本領(lǐng)域中已 知的其它方法。不經(jīng)腸是指一般與注射相關(guān)的傳遞途徑，包括眶內(nèi)、輸注、動脈內(nèi)、頸動脈 內(nèi)、囊內(nèi)、心、內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、子宮內(nèi)、靜脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜 下、包囊下、皮下、經(jīng)粘膜或經(jīng)氣管。經(jīng)由不經(jīng)腸途徑，組合物可以呈用于輸注或用于注射的 溶液或懸浮液形式，或呈凍干粉末形式。
[0024] 如本文所用，"調(diào)節(jié)（Modulation) "或"調(diào)節(jié)（modulates) "或"調(diào)節(jié)（modulating) " 是指反應(yīng)的上調(diào)（即活化或刺激）、下調(diào)（即抑制或遏制）或組合或分開的兩者。
[0025] 如本文所用，"藥學(xué)上可接受的載劑"是指適用于本發(fā)明的常規(guī)的藥學(xué)上可接受的 載劑。
[0026] 如本文所用，"促進(jìn)（Promote) "和/或"促進(jìn)（promoting) "是指細(xì)胞或生物體的 具體特性加強。
[0027] 如本文所用，"受試者"包括所有動物，包括哺乳動物和其它動物，包括（但不限 于）伴侶動物、家畜和動物園動物。術(shù)語"動物"可以包括任何活的多細(xì)胞脊椎動物生物體， 一種包括例如哺乳動物、鳥、猿、犬、貓、馬、牛、嚙齒動物等等的類別。同樣，術(shù)語"哺乳動物" 包括人與非人哺乳動物。
[0028] 如本文所用，"治療有效量"是指足以在所治療的受試者中實現(xiàn)所期望的作用的指 定組合物或組合物中活性劑的量。治療有效量可能視多種因素而改變，包括（但不限于） 受試者的生理條件（包括年齡、性別、疾病類型和階段、全身狀態(tài)、對給定劑量的反應(yīng)、所期 望的臨床作用）和施用途徑。臨床和藥理領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)的實驗確定治療 有效量。
[0029] 如本文所用，"治療（Treat) "、"治療（treating) "和"治療（treatment) "是指治 療性治療與防治性或預(yù)防性措施，其中目標(biāo)是防止或減緩（減輕）目標(biāo)病狀、疾病或病癥 (總起來說"病"），即使治療最終不成功。需要治療者可以包括已患病者，以及有患病傾向 者，或預(yù)防病者。
[0030] 如所述，人多潛能干細(xì)胞（hPSC)的分離和表征和哺乳動物中單性生殖和/或體細(xì) 胞核轉(zhuǎn)移（SCNT)技術(shù)的突破已經(jīng)提高了產(chǎn)生潛在無限的hPSC來源以用于研究中的可能 性，其中可應(yīng)用于組織修復(fù)和移植藥學(xué)。
[0031] 關(guān)于單性生殖，在一些情況下可以應(yīng)用消除所得細(xì)胞中父系的影響，以將主要組 織相容性復(fù)合物（MHC)多樣性減至最少。此允許產(chǎn)生與寬泛患者群體廣泛免疫相容的單性 生殖體衍生的人多潛能干細(xì)胞（pn-hPSC)。產(chǎn)生純合的pn-hPSC細(xì)胞系通過消除雜合變異 而進(jìn)一步提高潛在的免疫相容性。在僅僅一組等位基因純合表達(dá)的情況下，此允許所得的 pn-hPSC譜系更容易與患者相配。舉例來說，已經(jīng)報導(dǎo)針對共同單倍體而選擇的一組少至十 種HLA純合pn-hPSC譜系可以提供幾乎40%英國接受者的完全HLA-A、HLA-B和HLA-DR匹 配，和幾乎65%的有益匹配。當(dāng)在治療背景下考慮應(yīng)用SCNT時存在類似的益處。經(jīng)由SCNT 獲得的細(xì)胞（NT-hPSC)將攜帶患者的核遺傳物質(zhì)并因此是個別患者特異性的。此形式的自 體同源移植允許細(xì)胞移植至免疫排斥風(fēng)險顯著減少的患者。
[0032] 單性生殖和SCNT技術(shù)都涉及人工卵母細(xì)胞活化，此依賴于模擬在自然受精期間 發(fā)生的鈣信號傳導(dǎo)變化。正常卵母細(xì)胞發(fā)育依賴于高水平的中期促進(jìn)因子（MPF)活性以使 卵母細(xì)胞停滯在中期II (Mil)期。MII卵母細(xì)胞的停滯被細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+)水平因精子 進(jìn)入所引起的變化破壞。此后面為將卵母細(xì)胞從停滯釋放的周期素 B(MPF調(diào)節(jié)亞基）的靶 向降解、前核形成和減數(shù)分裂和有絲分裂過程的開始。
[0033] 作為第一步驟，單性生殖卵母細(xì)胞活化依賴于人工的鈣改變策略來將培養(yǎng)的卵母