細胞從停滯釋放。實例包括添加鈣離子載體、輸送離子跨越雙層脂質(zhì)的脂質(zhì)可溶的分子，例 如伊屋諾霉素和A23817。替代策略依賴于電活化或離子的直接注射。單性生殖中的第二 重要步驟涉及維持MPF/周期素 B抑制，此預防第二極體排出（2PBE)的排出。此引起二倍 體（2個母系基因組）單性生殖體的產(chǎn)生，此可以進一步培養(yǎng)成胚泡以用于pn-hPSC細胞分 離。因為與SCNT相關，所以核轉(zhuǎn)移（即重構）卵母細胞的重構后面還有使用鈣改變技術活 化卵母細胞。
[0034] 然而，這些當前的SCNT和/或單性生殖技術每一者中存在顯著的限制。舉例來說， 雖然已經(jīng)報導添加蛋白質(zhì)磷酸酶抑制劑咖啡因至綿羊卵母細胞可增加成熟促進因子（MPF) 和有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK)的活性且已經(jīng)在猴卵母細胞中報導類似的益處，但胚 泡形成的頻率未得到增強。此外，經(jīng)由鈣離子載體、電活化或直接注射的鈣活化未產(chǎn)生與自 然受精相同的鈣時間安排、空間調(diào)節(jié)或持續(xù)時間。添加進一步復雜性的是對鈣的作用也似 乎是物種特異性的。在一些情況下，用激酶抑制劑，如6-二甲基氨基嘌呤出-DMAP)、乙醇 和如放線菌酮（CHX)等蛋白質(zhì)合成抑制劑額外處理的使用用以增強MPF失活，如通過牛類 動物、小鼠和其它動物模型所獲悉。雖然添加此類試劑有效，但可能存在其它缺點。舉例來 說，雖然在單性生殖活化期間添加6-DMAP預防第二極體的排出和二倍體細胞的產(chǎn)生，但此 方法不允許產(chǎn)生更廣泛免疫相容性的純合hPSC細胞系。此外，
[0035] 因為與SCNT相關，所以已存在的技術被非整倍性和低效率的核程序重排阻礙，導 致高速的發(fā)育停止和細胞死亡。在去核、重構期間的結(jié)構和基因毒性應力以及卵母細胞活 化無效和在SCNT接合子的第一有絲分裂期間的缺陷都已經(jīng)被提出引起使用SCNT的不良發(fā) 育速率。
[0036] 為建立有效產(chǎn)生免疫相容性和/或患者特異性hPSC的技術，本發(fā)明者比較了不同 的方案，其中變化是：1)重構、2)活化和3)供體細胞。對所有三個方面的了解改善將提供 有效的SCNT技術，而改善的用于活化卵母細胞的方法將提供優(yōu)良的單性生殖的方法。因 此，本文中描述的技術提供了進行重構、活化和供體細胞選擇的變化的比較，并成功地鑒別 出人單性生殖和/或SCNT的有效條件。
[0037] 本文中描述了一種用于體細胞核轉(zhuǎn)移（SCNT)的方法。在一個實施方案中，用于 SCNT的方法包括卵母細胞的去核、一個或多個供體核的轉(zhuǎn)移、重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞（胚 胎）的活化以及任選地進一步培養(yǎng)成胚泡和多潛能干細胞（PSC)從胚泡的衍生。在其它實 施方案中，此包括分離一個或多個供體核以注射至去核的卵母細胞中。
[0038] 在不同的實施方案中，卵母細胞去核包括去除中期II(MII)期卵紡錘體。在不同 的實施方案中，去除第一極體（IPBE)。在另一個實施方案中，所述方法包括在成熟結(jié)束前使 卵丘細胞裸露。在一個實施方案中，利用實時的基于非紫外線的對IPBE的監(jiān)測，監(jiān)測卵母 細胞。在另一個實施方案中，監(jiān)測在缺乏染色或標記試劑，例如Hoechst染色劑下進行。在 一個實施方案中，此包括使用偏光顯微鏡，例如Research Instruments (CRi) Oosight?成像 系統(tǒng)。舉例來說，此可以包括用545nm偏振光目測所收獲的收獲MII卵母細胞中透明帶和 紡錘體復合物。在另一個實施方案中，卵母細胞去核包括使用波狀輪廓的微量吸液管，其允 許刺穿卵母細胞膜和從卵母細胞去除1PBE。在另一個實施方案中，卵母細胞去核包括使用 壓電性鉆頭。在其它實施方案中，去核在含有細胞分裂抑素 B和任選地蛋白質(zhì)磷酸酶抑制 劑（例如咖啡因）的去核培養(yǎng)基中進行。
[0039] 在另一個實施方案中，供體核的轉(zhuǎn)移包括使用改變卵母細胞的細胞膜結(jié)構的試 劑。在一個實施方案中，通過使用改變卵母細胞的細胞膜結(jié)構的試劑將卵母細胞去核包括 與體細胞融合。舉例來說，供體核的轉(zhuǎn)移可以包括對注射吸移管（例如12um直徑）提供3-4 個供體細胞，在含有例如仙臺病毒包膜蛋白等副粘病毒或副粘病毒蛋白的一些溶液中排出 供體細胞。此后面為使用注射吸移管取回細胞，以一定距離（4-5個細胞長）將供體細胞分 開，呈直線排列，用固持吸移管固持卵母細胞，將具有供體細胞的注射吸移管推進卵母細胞 中。在不同的實施方案中，推進注射吸移管包括不破壞卵膜質(zhì)膜，和將一個核供體細胞插入 卵母細胞的卵黃周隙（透明帶與細胞膜之間的空間）中，以使核供體細胞與卵膜質(zhì)膜（位 于透明帶下）接觸。在不同的實施方案中，吸移管的取出不破壞卵膜與供體細胞之間的接 觸。在不同的實施方案中，進一步培育卵母細胞。在不同的實施方案中，細胞在供體細胞插 入后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多分鐘融合。在不同的實施方案中，細 胞在供體插入后10分鐘融合。任選地，對于未成功融合的細胞，重復以上程序。在不同的 實施方案中，在整個過程中使用例如Oosight?成像系統(tǒng)等偏光顯微鏡。
[0040] 在一個實施方案中，供體核的轉(zhuǎn)移可以包括電學細胞操縱，例如電融合。在其它實 施方案中，所述方法可以包括分離體細胞核供體、干細胞核供體和生殖細胞核供體的核。在 其它實施方案中，所述方法可以包括分離體細胞核用于SCNT，接著經(jīng)由吸移管或壓電性注 射來注射一個或多個供體核。在不同的實施方案中，供體核來自于細胞，例如皮膚成纖維細 胞、白血球、毛囊或任何其它體細胞核供體。在另一個實施方案中，本發(fā)明描述一種方法，其 包括從生殖細胞供體分離和制備核。在不同的實施方案中，核的分離包括組織活檢、抽血或 其它獲得組織樣品的方式，用機械分離、膠原酶消化、洗滌、基于離心機的密度梯度分離和/ 或與標準培養(yǎng)基一起培養(yǎng)對此組織進行加工。
[0041] 在其它實施方案中，所述方法可以包括分離和/或修飾體細胞核供體、干細胞核 供體和生殖細胞核供體的核。在不同的實施方案中，此包括甲基化改變試劑，例如表觀遺傳 染色質(zhì)和/或組蛋白修飾試劑和/或DNA修飾試劑。在某些實施方案中，此包括蛋白質(zhì)精 氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMTl)和輔助活化子相關的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(CARM1/PRMT4)或孤兒 核受體雌激素相關受體β (Esrrb)蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，甲基化改變試劑和/SDNA 修飾被表達為經(jīng)修飾的重組蛋白質(zhì)。舉例來說，CARMl和Esrrb可以用7χ精氨酸（7R)細 胞滲透肽（CPP)或本領域技術人員已知增強蛋白質(zhì)和肽穿過細胞膜和核膜、增強結(jié)合和/ 或轉(zhuǎn)活化于DNA的任何其它蛋白質(zhì)修飾。在其它實施方案中，所述方法包括使用基于轉(zhuǎn)錄 因子的程序重排，用八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4(0ct-4)、性別決定區(qū)Y-box-2(Sox-2)、nanog、 !(!?即卩61樣因子-4(1(11<-4)、]\^〇0、(3-]\15^、鋅指蛋白-42(1^叉-1/2辦-42)、16；1^7厶、畸胎癌衍 生生長因子（Tdgf)和/或端粒重復序列結(jié)合因子（Terf-I)將核供體細胞在表觀遺傳學上 進行程序重排。在不同的實施方案中，所述方法包括直接壓電性注射、病毒注射、脂質(zhì)體注 射或胞質(zhì)內(nèi)注射的其它方法。在不同的實施方案中，轉(zhuǎn)錄因子可以呈可以在核轉(zhuǎn)移至去核 的卵母細胞之前應用的mRNA、蛋白質(zhì)和/或細胞提取物形式傳遞。在其它實施方案中，所述 方法包括使用HDAC抑制劑（I、II和III類）或DNMT3a和DNMT3b抑制劑。
[0042] 在另一個實施方案中，本發(fā)明描述一種活化重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞的方法。在一 個實施方案中，活化重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞包括在活化培養(yǎng)基中在37°C下處理核轉(zhuǎn)移卵母 細胞5分鐘，接著在裂解培養(yǎng)基中洗滌。在不同的實施方案中，活化培養(yǎng)基是無 HEPES的培 養(yǎng)基、無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基、G1或G2培養(yǎng)基、裂解培養(yǎng)基、裂解輔助培養(yǎng)基、IVF培養(yǎng)基、胚泡 形成培養(yǎng)基或普遍人胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)基。在某些實施方案中，所述活化培養(yǎng)基包括鈣離子載 體。在不同的實施方案中，所述鈣離子載體是伊屋諾霉素、A23187、白僵菌毒素、X-537A、燕 麥曲菌素、單一大環(huán)聚醚或大二環(huán)化合物或穴狀化合物。在不同的實施方案中，活化培養(yǎng)基 包括醇，例如乙醇。在不同的實施方案中，活化培養(yǎng)基包括硫柳汞。在不同的實施方案中，活 化培養(yǎng)基包括1、2、3、4、5、5或更多微摩爾濃度的伊屋諾霉素。在其它實施方案中，所述方 法包括MII期卵母細胞的電活化。在一個實施方案中，電活化包括電融合培養(yǎng)基中的電脈 沖。在不同的實施方案中，電融合培養(yǎng)基包括〇. 1-0. 5M甘露糖醇、0.0 l-ImM MgS04 ·7Η20、 0. 01-lmg/ml 聚乙烯醇、l-10mg/ml 人血清白蛋白、0. 005-0. 5mM CaC12 ·2Η20。在一個實施 方案中，電融合培養(yǎng)基包括〇· 3Μ甘露糖醇、0· ImM MgS04 · 7Η20、0· lmg/ml聚乙烯醇、3mg/ ml人血清白蛋白、0.05mM CaC12 · 2H20。在一個實施方案中，活化重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞 允許染色質(zhì)凝聚、紡錘體形成和化學活化。在其它實施方案中，可以應用電脈沖、任選地 接著6-DMAP的組合，例如0. 25M d-山梨糖醇緩沖液中（2X 50 μ s DC脈沖，2. 7kV/CM)和 6-DMAP(2mM，4小時）。在其它實施方案中，各種描述的培養(yǎng)基，例如無 HEPES的培養(yǎng)基、無 蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基、Gl或G2培養(yǎng)基、裂解培養(yǎng)基、裂解輔助培養(yǎng)基、IVF培養(yǎng)基、胚泡形成培養(yǎng) 基或普遍人胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)基任選地包括生長因子，例如GM-CSF或IGFl。在不同的實施方案 中，生長因子可以在核轉(zhuǎn)移后1、2、3、4、5、6、7或更多天添加。
[0043] 在不同的實施方案中，核轉(zhuǎn)移卵母細胞在后活化培養(yǎng)基中處理以完全活化。在不 同的實施方案中，接著活化的重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞在后活化培養(yǎng)基中培育。在不同的實 施方案中，后活化培養(yǎng)基是無 HEPES的培養(yǎng)基、無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基、Gl或G2培養(yǎng)基、裂解 培養(yǎng)基、裂解輔助培養(yǎng)基、IVF培養(yǎng)基、胚泡形成培養(yǎng)基或普遍人胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)基。在不同 的實施方案中，所述后活化培養(yǎng)基包括6-DMAP、嘌呤霉素、乙醇、放線菌酮（CHX)、曲古霉 素 A(TSA)和/或細胞分裂抑素 B(CB)。在不同的實施方案中，活化的卵母細胞在后活化 培養(yǎng)基中培育不到 30、30-45、45-60、60-90、90-120、120-150、150-180、180-210、210-240、 240-270、300-330、330-360、360-390或超過390分鐘。在某些實施方案中，活化的卵母細 胞培育240、300或360分鐘。在不同的實施方案中，活化和后活化步驟在減少氧條件下進 行。在某些實施方案中，減少氧條件包括約80-85%、85-90%、90-95%、95%或更多吧、約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多02和約1%、2%、3%、4%、5%、6%、 7%、8%、9%或10%或更多C02。在某些實施方案中，減少氧條件包括約90% N2、約5% 02 和約5%C02。在不同的實施方案中，后活化培養(yǎng)基包括裂解培養(yǎng)基中1、2、3、4、5、5或更多 毫摩爾濃度的6-DMAP，歷時1、2、3、4、5、5或更多小時，在例如37°C等溫度中在例如約90% N2、約5% 02和約5% C02的氣體混合物中培育。
[0044] 在后活化培養(yǎng)基中培育后，將后活化的卵母細胞在洗滌培養(yǎng)基中培育。在不同的 實施方案中，洗滌培養(yǎng)基是無 HEPES的培養(yǎng)基、無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基、Gl或G2培養(yǎng)基、裂解培 養(yǎng)基、裂解輔助培養(yǎng)基、IVF培養(yǎng)基、胚泡形成培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，培養(yǎng)基不需要 連續(xù)改變培養(yǎng)基，例如普遍人胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)基。在某些實施方案中，洗滌培養(yǎng)基包括TSA。 在某些實施方案中，后活化的卵母細胞在包括TSA的洗滌培養(yǎng)基中培育240、300或360分 鐘。在一個實施方案中，洗滌后活化的重構核轉(zhuǎn)移卵母細胞，并進一步培養(yǎng)。在一個實施方 案中，后活化的重構核轉(zhuǎn)移卵母細胞在無6-DMAP的培養(yǎng)基中洗滌。在其它實施方案中，各 種描述的培養(yǎng)基，例如無 HEPES的培養(yǎng)基、無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基、Gl或G2培養(yǎng)基、裂解培養(yǎng)基、 裂解輔助培養(yǎng)基、IVF培養(yǎng)基、胚泡形成培養(yǎng)基或普遍人胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)基任選地包括生長因 子，例如GM-CSF或IGF1。在不同的實施方案中，生長因子可以在核轉(zhuǎn)移后1、2、3、4、5、6、7 或更多天添加。
[0045] 在另一個實施方案中，活化和/或后活化步驟包括添加從精子、其衍生物和提取 物分離的因子。在一個實施方案中，使用任何描述的注射法將人精子因子注射至活化的重 構卵中。在一個實施方案中，使用任何描述的注射法將人精子因子注射至后活化的重構卵 中。在不同的實施方案中，約一、二、三或四天后，將后活化的重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞轉(zhuǎn)至 裂解培養(yǎng)基。在某一實施方案中，后活化約一天后，將重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞轉(zhuǎn)至裂解培 養(yǎng)基。在不同的實施方案中，精子因子包括例如從精細胞內(nèi)部或外部存在的細胞蛋白質(zhì)分 離的因子。在一個實施方案中，使用清潔劑和射出精液的機械摻合獲得全精子提取物。在 另一個實施方案中，全精細胞提取物用DNA酶I和RNA酶處理。在另一個實施方案中，將 粗提取物在緩沖液中洗滌并離心（20, 000g，2小時）。在其它實施方案中，收集新鮮的射 出的人精液，并在900g下離心10分鐘，以去除精清，接著離心塊在含有5mg/mL牛血清白 蛋白的Sperm-TALP中再懸浮，并在相同的設定下離心，接著去除上清液且離心塊在核分離 培養(yǎng)基（NIM:125mM KCl、2.6mM NaCl、7.8mM Na2HP04、1.4mM KH2P04、3.0mM EDTA 二鈉鹽； pH 7.45)中再懸浮至每毫升20X 10s個精液的最終濃度并離心以去除Sperm-TALP。去除 Sperm-TALP后，離心塊用含有ImM二硫蘇糖醇、IOOmM抗纖維蛋白溶酶肽、IOOmM抗蛋白酶 和IOOmg = mL大豆胰蛋白酶抑制劑的NIM再懸浮至相同體積，接著冷凍（每個循環(huán)液體N2 中5分鐘）和解凍（每個循環(huán)15°C下5分鐘）循環(huán)四次，其中在2°C下在20, 000X下50分 鐘形成致密的精子離心塊。最后，小心地去除所得上清液，等分，并保持在_80°C下，直至使 用。
[0046] 在不同的實施方案中，將后活化的重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞進一步培養(yǎng)成胚泡。在 一個實施方案中，后活化的重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞在例如奎因培養(yǎng)基（Quinn' s medium) 等SAGE裂解培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)。在另一個實施方案中，培養(yǎng)基促進多潛能性，例如3i 培養(yǎng)基（神經(jīng)基礎培養(yǎng)基50%、DMEM/F-1250%、N2補充物l/200v/v、B27補充物l/100v/ v、100mM L-谷氨酰胺 1/100v/v、0· ΙΜβ -ME l/1000v/v、SU5402(FGFR 抑制劑）2 μΜ、 ΗΗ84352 (ERK級聯(lián)抑制劑）0. 8 μ M、CHIR99021 (GSK3抑制劑）3 μ Μ)或經(jīng)改性的3i培養(yǎng)基 (包括Η)0325901(ΜΑΡΚ抑制劑）0. 4μΜ)。在一個實施方案中，進一步培養(yǎng)1、2、3、4、5、5或 更多天。在一個實施方案中，在具有程序重排因子和/或甲基化改變試劑的培養(yǎng)基中提供 額外的培養(yǎng)。在不同的實施方案中，額外的培養(yǎng)為在補充有CARMl和/或Esrrb的G2培 養(yǎng)基中3天。舉例來說，CARMl和/或Esrrb每一者可以按培養(yǎng)基中每毫升0.5、1、1.5、2、 2. 5、3、3. 5、4、4. 5、5或更多微克的濃度提供。在一些實施方案中，CARMl和/或Esrrb每一 者按培養(yǎng)基中2 μ g/ml的濃度提供。
[0047] 在不同的實施方案中，進一步培養(yǎng)成胚泡和從胚泡衍生多潛能干細胞（pSC)包括 用酸性臺式液（Tyrode's solution)處理培養(yǎng)的胚泡以去除透明帶（ZP)。在不同的實施方 案中，處理歷時幾（例如1-5)秒。在不同的實施方案中，去除ZP后面為在H印es-HTF培養(yǎng) 基中洗滌。在不同的實施方案中，分離內(nèi)細胞團（ICM)包括拋棄胚泡的滋養(yǎng)層。在不同的實 施方案中，ICM細胞涂鋪在小鼠胚胎飼養(yǎng)層（MEF)上，MEF在涂鋪前一天制備。在一些實施方 案中，將全胚泡涂鋪在MEF上。舉例來說，此方法包括使胚泡的透明帶裸露。在不同的實施 方案中，所述方法包括用 ifepes-HTF 培養(yǎng)基中 0· 05、0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、 0. 9或1%鏈霉蛋白酶去除胚泡的透明帶。在一個實施方案中，所述方法包括用Hepes-HTF 培養(yǎng)基中0. 5%鏈霉蛋白酶去除胚泡的透明帶。。在另一個實施方案中，所述方法包括施加 含鏈霉蛋白酶的TH3(SAGE胚泡培養(yǎng)基）培養(yǎng)基，歷時1-10、10-20、20-30、30-60、60-120、 120-180或>180秒。在另一個實施方案中，所述方法包括施加含0. 5%鏈霉蛋白酶的HTF 培養(yǎng)基，歷時30-60秒。在一個實施方案中，胚泡來源于從卵母細胞的單性生殖中獲得的單 性生殖體。在一個實施方案中，hPSC譜系是單性生殖體衍生的人多潛能hPSC(pn-hPSC)細 胞系。在另一個實施方案中，胚泡來源于從供體細胞核之體細胞核轉(zhuǎn)移（SCNT)至接受體卵 母細胞中所獲得的重構的核轉(zhuǎn)移卵母細胞。在一個實施方案中，hPSC譜系是體細胞核轉(zhuǎn)移 人多潛能hPSC(NT-hPSC)細胞系。在另一個實施方案中，本發(fā)明描述了一種免疫外科的方 法，其包括內(nèi)細胞團（ICM)從滋養(yǎng)外胚層細胞的機械分散。在不同的實施方案中，將裸露的 胚泡在37°C下用兔抗人脾血清處理約10、20、25、30、35、40、45或60分鐘。在一個實施方 案中，將裸露的胚泡在37 °C下用兔抗人脾血清處理約30分鐘。在一個實施方案中，所述方 法包括用TH3 (SAGE胚泡培養(yǎng)基）洗滌裸露的胚泡，在37 °C下在用HECM-9 (SAGE胚泡培養(yǎng) 基）重構的豚鼠補體中培育30分鐘。在不同的實施方案中，通過短暫暴露（45-60秒）于 TH3(hepes-HTF)培養(yǎng)基中0. 5%鏈霉蛋白酶或酸性臺式液去除擴展的胚泡的透明帶。在一 個實施方案中，所述方法任選地包括使用小孔吸移的機械細胞分散，或使用Zilos-tk單元 (Hamilton Thorne)將內(nèi)細胞團細胞與滋養(yǎng)外胚層細胞分離的激光輔助的孵化法。
[0048] 在一個實施方案中，用于SCNT的方法包括卵母細胞的去核、供體核的轉(zhuǎn)移、重構 的核轉(zhuǎn)移卵母細胞的活化和任選地進一步培養(yǎng)成胚泡、多潛能干細胞（psc)從胚泡的衍 生。在一個實施方案中，卵母細胞去核包括去除中期II期卵紡錘體。在不同的實施方案中， 去除第一極體（IPBE)。在一個實施方案中，供體核的轉(zhuǎn)移包括對注射吸移管（例如12um直 徑）提供3-4個供體細胞，在含有仙臺病毒包膜蛋白的一些溶液中排出供體細胞，使用注射 吸移管取回細胞，以一定距離（4-5個細胞長）將供體細胞分開，呈直線排列，用固持吸移管 固持卵母細胞，將具有供體細胞的注射吸移管推進卵母細胞中。在不同的實施方案中，推