提供以下實(shí)施例以更好地說明所要求的發(fā)明且不應(yīng)被解釋為限制主題物質(zhì)的范 圍。在提及特定材料的程度上，其目的僅僅是說明且不意圖限制本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人 員可以在不運(yùn)用創(chuàng)新能力和不脫離本發(fā)明的范圍下發(fā)展同等的措施、組合物或反應(yīng)物。
[0068] 實(shí)施例1
[0069] 與單性生殖相關(guān)的一般程序
[0070] 單性生殖的關(guān)鍵程序涉及1)制備人MII期卵母細(xì)胞，2)活化卵母細(xì)胞，3)產(chǎn) 生單性生殖體，4)進(jìn)一步體外培養(yǎng)達(dá)至胚泡期，和5)從培養(yǎng)的胚泡衍生人多潛能干細(xì)胞 (hPSC)。經(jīng)由此過程衍生的細(xì)胞是單性生殖體衍生的人多潛能干細(xì)胞（pn-hPSC)。
[0071] 實(shí)施例2
[0072] 與SCNT相關(guān)的一般程序
[0073] 體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移（SCNT)涉及與單性生殖重疊的技術(shù)，不過關(guān)鍵差別涉及供體核轉(zhuǎn) 移至接受者卵母細(xì)胞和胚胎重構(gòu)。更確切地說，SCNT包括1)制備核供體細(xì)胞，2)制備人 MII期卵母細(xì)胞，3)卵母細(xì)胞去核，4)體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至去核的卵母細(xì)胞，5)活化體細(xì)胞核轉(zhuǎn) 移（重構(gòu)）的卵，6)體外培養(yǎng)重構(gòu)卵達(dá)至胚泡期，和7)從那些胚胎衍生胚胎干細(xì)胞系。經(jīng) 由此過程衍生的細(xì)胞是體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移人多潛能干細(xì)胞（NT-hPSC)。
[0074] 實(shí)施例3
[0075] 使用成人成纖維細(xì)胞制備核供體細(xì)胞系
[0076] 供體患者的成纖維細(xì)胞可以由皮膚活檢產(chǎn)生，其中個(gè)別細(xì)胞通過胰蛋白酶消化或 類似的過程從單層提取。接著可以使用以下示例方案從成人成纖維細(xì)胞中獲得核。
[0077] 1.在局部麻醉下獲得皮膚或其它組織活檢（50mg，0. 5X0. 5cm)。
[0078] 2.在PBS中洗滌組織片段兩次。
[0079] 3.在IOOmm培養(yǎng)皿上用外科手術(shù)刀機(jī)械粉碎組織并從粉碎的組織小心地去除 PBS0
[0080] 4.將組織團(tuán)粒再懸浮于4. 5ml補(bǔ)充有10% FBSU%非必需氨基酸和10ug/ml青霉 素-鏈霉素溶液以及500ul (2000單元/毫升）II型膠原酶（Life Technologies)的DMEM 中。
[0081] 5.置于培育箱中過夜。
[0082] 6.在300 X G下離心3分鐘，并將細(xì)胞團(tuán)粒再懸浮于具有10% FBS的DMEM中。
[0083] 7.將細(xì)胞接種至60mm培養(yǎng)皿中并隨后在具有10% FBS、1%非必需氨基酸和 10耶/1^青霉素-鏈霉素溶液的01^1中在37°(：下在5%〇)2和95%空氣下培養(yǎng)直至匯合。
[0084] 8. -旦細(xì)胞達(dá)到80 %匯合，低溫保存1/2初始產(chǎn)物，并將剩余細(xì)胞分成1:3比率， 且在上文提及的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們。再重復(fù)此程序2次以獲得足夠細(xì)胞用于SCNT和將來 的基因型分析。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在補(bǔ)充有10% DMSO的FBS中低溫保存所有剩余的細(xì) 胞。新鮮制備的細(xì)胞或者低溫保存的細(xì)胞都可以用作核供體。
[0085] 實(shí)施例4
[0086] 使用卵丘細(xì)胞制備核供體細(xì)胞系
[0087] 對于SCNT，還將如下所述從供體的卵丘細(xì)胞中獲得供體核，或從其它組織，包括市 售的成人干細(xì)胞中獲得供體核。接著可以使用以下示例方案從卵丘細(xì)胞中獲得核。
[0088] 1.大概一半的來自每一個(gè)體的細(xì)胞制劑作為核供體用于SCNT，且其余細(xì)胞制劑 將迅速冷凍用于基因型分析。
[0089] 2.在裸露過程期間收集卵丘細(xì)胞至L 5ml微量離心管中。添加 Hepes-HTF達(dá) I. 5ml并在1200rpm下離心1分鐘。
[0090] 3.傾析上清液，僅僅剩下細(xì)胞團(tuán)粒，添加并混合團(tuán)粒與IOOul 4% PVP溶液（PVP， Mff 36000, Calbiochem和San Diego, CA)。這些細(xì)胞準(zhǔn)備用于核注射。
[0091] 實(shí)施例5
[0092] 卵巢刺激方案和卵母細(xì)胞提取
[0093] 將患者預(yù)先用低劑量口服避孕藥處理7-14天。停服口服避孕藥后，將施用促性腺 激素（果納芬（Gonal-F)或佛爾替姆（Follistim))和（微劑量路普諾（Lupronor)hCG或 美諾孕（Menopur))。起始劑量基于患者特性（年齡、第3天FSH、APC)并通過個(gè)別醫(yī)師測 定。在第6天開始對卵泡生長和子宮內(nèi)膜厚度進(jìn)行經(jīng)陰道的超聲波評估，且在八次連續(xù)臨 床就診的每一次，測量血清E2水平。此后，基于超聲波檢查的結(jié)果和血清E2水平，可以調(diào) 整監(jiān)測頻率和促性腺激素的量。
[0094] 除血清E2水平之外，hCG觸發(fā)的天數(shù)（和因此刺激的總天數(shù)）還將基于卵泡大小 和數(shù)目。路普諾（Lupron)或hCG的劑量可以按250 μ g劑量施用。施用hCG后36小時(shí)進(jìn) 行卵提取?；颊邔⒃谄渎烟崛『笠惶熘匦麻_始口服避孕藥。
[0095] 實(shí)施例6
[0096] 具體來說卵巢刺激
[0097] 可以使用以下示例程序進(jìn)行卵提取。
[0098] 1.在低劑量口服避孕藥7-14天后用重組卵泡刺激激素（FSH)佛爾替姆，100-150 單元，Schering-Plough)處理年齡在20-34之間的健康女性供體，并從第1天開始，微小劑 量重組 LH (路普諾或 hCG，250ug) EMD Serono 〇
[0099] 2. FSH通常從100-150單元開始，并可以在卵泡形成進(jìn)行時(shí)調(diào)整。
[0100] 3.當(dāng)兩個(gè)主要卵泡到達(dá)18mm直徑時(shí)給予單一劑量的路普諾或hCG(250ug)，以誘 發(fā)卵母細(xì)胞成熟。
[0101] 實(shí)施例7
[0102] 收集卵母細(xì)胞
[0103] 可以使用以下示例程序進(jìn)行卵母細(xì)胞的收集。
[0104] 1.從吸出的卵泡液中收集卵丘細(xì)胞團(tuán)于具有奎因的Advantage受精培養(yǎng)基（SAGE 目錄號1021)的50 X 9mm皮式培養(yǎng)皿中。
[0105] 2.在37°C、5% C02、濕潤培育箱中用透明質(zhì)酸酶（40U/ml)處理收集的卵丘細(xì)胞團(tuán) 約2-3分鐘，直至卵丘細(xì)胞分散。
[0106] 3.使用剝離器尖端（Mid-Atlantic Diagnostic，#MXL3_100u)去除任何殘余的顆 粒細(xì)胞。
[0107] 4.用奎因受精培養(yǎng)基洗滌卵母細(xì)胞兩次。
[0108] 5.制備50ul液滴，于Willco-Dish玻璃培養(yǎng)皿（50X9mm)中經(jīng)礦物油覆蓋。
[0109] 實(shí)施例8
[0110] 卵母細(xì)胞提取和制備
[0111] 將在綠光（波長>500nm)照射的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行卵母細(xì)胞提取和制備。
[0112] 1.在路普諾或hCG注射后36小時(shí)給患者服用鎮(zhèn)靜劑咪達(dá)唑侖（Midazolam) 5-7. 5m g (Versed，Roche 和 Nutley.NJ，USA)和芬太尼（Fentanyl) 50_75ug (Abbott Pharmaceutica 1，Abbott Park，IL USA)，且接著使用如先前描述的超聲波指導(dǎo)提取卵母細(xì)胞。
[0113] 2.在具有5 % C02的濕潤培育箱中在IVF培養(yǎng)基（奎因 IVF培養(yǎng)基，SAGE Biopharma，Bedminster，NJ)中洗滌和培育新鮮分離的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合物（COC) 2 小時(shí)。
[0114] 3.用透明質(zhì)酸酶（100IU/ml，Sigma，St. Louis，MO USA)處理 COC 2 分鐘并用小 孔微量吸液管（150um直徑）使其裸露。具有單一第一極體的裸露卵母細(xì)胞分類為中期 II(MII)并用于 SCNT。
[0115] 實(shí)施例9
[0116] 體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移
[0117] 使用 Oosight?紡錘體成像系統(tǒng)（Cambridge Research&Instrumentation, Wob urn，MA USA)目測中期II(MII)紡錘體的去核。此方法避免了 Hoechst染色和紫外光暴 露。將卵母細(xì)胞在具有含有0.5ug/ml細(xì)胞分裂抑素 B的HEPES (Cooper Surgical)的奎因 Advantage?培養(yǎng)基中預(yù)先培育5分鐘。
[0118] 使用具有去核吸移管（20um直徑）的Piezo沖擊式鉆機(jī)（PrimeTech, Tokyo, Japa η)進(jìn)行卵母細(xì)胞的去核。將通過操縱吸移管中明亮的橢圓形核復(fù)合物的存在確認(rèn)中期紡錘 體的去除。將制備供體人成纖維細(xì)胞（或同等的其它類型細(xì)胞）。使用用于去核的相同系 統(tǒng)融合或注射那些核供體細(xì)胞。所有程序都在不直接接觸熒光下進(jìn)行。
[0119] 實(shí)施例10
[0120] 體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移I :直接注射法
[0121] A)卵母細(xì)胞的去核
[0122] 1.將具有可見的第一極體的一批卵母細(xì)胞（10個(gè)）移至含有細(xì)胞分裂抑素 B(5ug/ml)的預(yù)平衡過的培養(yǎng)基。
[0123] 2.將卵母細(xì)胞移至在顯微操作皿上制備的小滴去核培養(yǎng)基〇fepeS-HTF+5ug/ml 細(xì)胞分裂抑素 B，Cooper Surgical)中。
[0124] 3.將具有卵母細(xì)胞的皿盤負(fù)載至具有加熱臺的顯微操作系統(tǒng)上。
[0125] 4.使用 Oosight?成像系統(tǒng)（Cambridge Research&Instrumentation, Woburn, MA USA)目測紡錘體，固持中期板在2點(diǎn)與4點(diǎn)位置之間的卵母細(xì)胞。
[0126] 5.將去核吸移管置于透明帶表面上（3點(diǎn)位置）并傳遞PIEZO (PrimeTech，Tokyo, J apan)脈沖以穿過帶打孔。
[0127] 6.在刺穿帶后立即推進(jìn)去核吸移管（在非常輕微的正壓下）至壓緊區(qū)域中。
[0128] 7.通過吸取，去除染色體-紡錘體復(fù)合物，以及小體積的細(xì)胞質(zhì)。
[0129] 8.對所有卵母細(xì)胞重復(fù)程序。
[0130] 9.在培養(yǎng)基（裂解培養(yǎng)基，Cooper Surgical)中徹底洗滌去核卵母細(xì)胞以去除痕 量細(xì)胞分裂抑素 B，并在核注射前在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15分鐘。
[0131] B)核轉(zhuǎn)移
[0132] 在 NT 之前，通過在 37°C下用 0.25% (v/v)胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies) 進(jìn)行胰蛋白酶消化30秒，從單層提取個(gè)別成纖維細(xì)胞（或其它類型核供體細(xì)胞），并隨后用 于NT。輕輕混合供體成纖維細(xì)胞至具有奎因受精培養(yǎng)基的液滴中。供體核可以來自裸露細(xì) 胞，和/或細(xì)胞在核轉(zhuǎn)移之前經(jīng)受表觀遺傳修飾。
[0133] 1.將核供體細(xì)胞（卵丘細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞）在！fepes-HTF (SAGE Biopharma) 中洗滌，離心，并在4% PVP溶液中復(fù)原。
[0134] 2.通過使用PIEZO系統(tǒng)施加若干脈沖和有力的吸移，分離核。
[0135] 3.使用PIEZO系統(tǒng)將核注射至去核卵母細(xì)胞的卵質(zhì)中。
[0136] 4.將注射的卵母細(xì)胞去除至新鮮培養(yǎng)基；在蛋白質(zhì)注射前培育30分鐘。
[0137] 5.將注射的卵母細(xì)胞去除至操縱皿以注射中心體核心蛋白的混合物（人極光B激 酶+hSET+NuMA)。所有蛋白質(zhì)都可得自CBI labs。
[0138] 6.注射蛋白質(zhì)，大概每一卵4pL。
[0139] 7.在活化前去除注射的卵母細(xì)胞并在培養(yǎng)基中培育30分鐘。
[0140] C)重構(gòu)卵的活化
[0141] 1.在37 °C下在活化培養(yǎng)基（5uM伊屋諾霉素）中處理NT卵5分鐘，并在裂解培養(yǎng) 基中徹底洗滌它們。
[0142] 2.在后活化培養(yǎng)基（具有5nM曲古霉素 A(trichostatin A，TSA)的裂解培養(yǎng)基 中2mM 6-DMAP)中再處理卵4小時(shí)。
[0143] 3.在無6-DMAP培養(yǎng)基中洗滌活化卵并在含有5nM TSA的培養(yǎng)基（裂解培養(yǎng)基） 中培育6小時(shí)，接著將其轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)基。
[0144] 4.開始2天在SAGE裂解培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化卵，并在隨后3天在SAGE胚泡培養(yǎng)基 中培養(yǎng)。
[0145] 實(shí)施例11
[0146] 改良的卵母細(xì)胞去核技術(shù)
[0147] 一些用于卵母細(xì)胞去核的主要技術(shù)包括上述的壓電性鉆頭刺穿和吸取，或空心針 尖刺穿和排出。另一眾所周知的技術(shù)包括使用大孔吸持吸移管的"筷子"法和經(jīng)由精細(xì)尖 端吸移管的卵母細(xì)胞的側(cè)邊刺穿和剝掉一部分細(xì)胞膜。經(jīng)由剪切運(yùn)動(dòng)，精細(xì)尖端吸移管允 許通過螯合刺穿破縫與的精細(xì)尖端吸移管之間的極體進(jìn)行提取來提取遺傳物質(zhì)。這些技術(shù) 的一個(gè)缺點(diǎn)是置于操縱卵母細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)力，其可能減弱細(xì)胞存活力并引起細(xì)胞系產(chǎn)生 效率低。
[0148] 本文中描述了一種改良的去核技術(shù)，其使用特別設(shè)計(jì)的去核吸移管。此"刀型吸 移管"可以通過牽引無菌玻璃管，接著玻璃管破裂并通過火琢熔成鈍圓形珠粒末端來制備。 吸移管的鈍圓形珠粒末端通過接觸和在顯微拉制儀上再牽引來銳化。此過程形成"刀型移 液管"，包括多個(gè)特征：1)實(shí)心尖銳的精細(xì)尖端，2)由牽引的珠粒末端引起的略微圓形輪廓 邊緣，和3)直徑大概50um的較大中空管體。與用于保持人成熟卵母細(xì)胞穩(wěn)定的火琢的保 持吸移管（外徑：120-150um;內(nèi)徑：20-30um)組合，可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良的去核顯微操作。
[0149] 舉例來說，如圖1中所示，"刀型吸液管"的輪廓允許在尖端抵著（B)通過保持吸 移管來保持穩(wěn)定的細(xì)胞的側(cè)邊前進(jìn)時(shí)，經(jīng)由（A)實(shí)心尖銳的精細(xì)尖端有效刺穿透明帶。（C) 刺穿之后，經(jīng)由圓形牽引的珠粒末端操縱卵母細(xì)胞以"修剪"裂縫和（D)極體定位于裂縫邊 緣附近。在較大的中空管體為使用者提供整體結(jié)構(gòu)以更容易地抓住刀型吸移管下，（E)定 位于裂縫附近的極體接著可以（F)擠出以供提取。這些特征一起組合在單一去核吸移管中 允許每一步用單一裝置快速地進(jìn)行，由此減少卵母細(xì)胞的物理操縱并減小細(xì)胞膜裂縫的大 小。接著可以通過Oosight?成像系統(tǒng)（偏光顯微術(shù)）確認(rèn)去核。
[0150] 實(shí)施例12
[0151] 體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移II :體細(xì)胞融合法
[0152] A)卵母細(xì)胞的去核，如所述。
[0153] B)體細(xì)胞轉(zhuǎn)移在卵黃周隙中
[0154] 1.在注射吸移管（12um直徑）中獲取3-4個(gè)供體細(xì)胞，排成一行。在此過程期間， 應(yīng)注意不破壞質(zhì)膜。
[0155] 2.用保持吸移管保持卵母細(xì)胞。
[0156] 3.將注射吸移管置于透明帶表面上并施加 PIEZO脈沖以穿過帶打孔。
[0157] 4.將具有供體細(xì)胞的注射吸移管推進(jìn)至卵母細(xì)胞中，不打破卵膜，并以核供體細(xì) 胞緊密地接觸卵膜的方式將一個(gè)核供體細(xì)胞輕輕地插入卵黃周隙中。
[0158] 5.輕輕地取出吸移管，最初相對迅速，接著緩慢。
[0159] 6.對整個(gè)卵母細(xì)胞組完成此程序，并將其返回至培育箱中。
[0160] C)卵母細(xì)胞-體細(xì)胞融合
[0161] 在電融合緩沖液（0. 3M D-山梨糖醇、0.1 mM乙酸鈣、0. 5mM乙酸鎂、0.1 mM HEPES、 0.5mg/ml 聚乙烯吡咯烷酮、50uM D-my〇-2,4，S、三磷酸肌醇）中用 BTX 200Electro Cell Manipulator?(BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA USA)使用 0.5mm 電融合腔室進(jìn)行 電融合。
[0162] 1.將3-4個(gè)卵母細(xì)胞-體細(xì)胞偶聯(lián)體排列在用電融合緩沖液覆蓋的電融合腔室的 2個(gè)線之間。
[0163] 2.施加160Kev/Cm的DC脈沖5微秒?；蛘撸梢允┘永?0秒的更長時(shí)間。
[0164] 3.在胚胎培養(yǎng)基中徹底洗滌重構(gòu)卵母細(xì)胞，并在4孔皿（10個(gè)細(xì)胞/孔）中在普 遍培養(yǎng)基（0.3%人血清白蛋白+普遍培養(yǎng)基）中培養(yǎng)它們。
[0165] 4.在起始脈沖后30分鐘內(nèi)檢查融合。針對未融合的偶聯(lián)體再重復(fù)一次。
[0166] D)重構(gòu)卵的活化
[0167] 使用與體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移I中相同的方法活化重構(gòu)的卵母細(xì)胞。
[0168] 實(shí)施例13
[0169] 基于仙臺病毒的卵母細(xì)胞-體細(xì)胞融合
[0170] 本文中描述了一種改良的用于實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞-體細(xì)胞融合的技術(shù)，其依賴于來自 反義的單股RNA仙臺病毒（SeV)的重組蛋白質(zhì)包膜的應(yīng)用。SeV病毒因其融合胚胎細(xì)胞的 能力而眾所周知，且可以應(yīng)用不含任何遺傳物質(zhì)的重組SeV表面包膜蛋白質(zhì)（SeV-E)而無 感染或增殖能力的風(fēng)險(xiǎn)。
[0171] SeV用于卵母細(xì)胞-體細(xì)胞融合從根據(jù)制造商方案（GenomONE-CF EX, Ishihara Sangyo Kaisha,目錄號ISK-CF001-EX)在懸浮緩沖液中制備凍結(jié)干燥的SeV-E開始。接著 懸浮緩沖液中的SeV-E添加至先前稀釋的20X細(xì)胞融合緩沖液中。接著經(jīng)由微滴添加，添 加組合的混合物緩沖液中的SeV-E，位于含有供體核體細(xì)胞的吸移管尖端與接受者去核卵 母細(xì)胞之間。細(xì)胞可以來自裸露細(xì)胞，和/或細(xì)胞在核轉(zhuǎn)移之前經(jīng)受表觀遺傳修飾。經(jīng)由 微滴用混合物緩沖液中的SeV-E涂布供體核體細(xì)胞和接受者去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜表面 允許在不使用電融合下發(fā)生體細(xì)胞融合。接受者卵母細(xì)胞上物理和電生理學(xué)應(yīng)力的此減少 改善了細(xì)胞存活力和有效的細(xì)胞系產(chǎn)生。
[0172] 實(shí)施例14
[0173] 使用基于仙臺病毒的卵母細(xì)胞-體細(xì)胞融合的改良技術(shù)
[0174] A)卵母細(xì)胞的去核
[0175] 使用實(shí)施例11和其它地方（圖1)中描述的"刀型吸移管"法去除MII期卵紡錘 體復(fù)合物。整個(gè)此程序中使用Oosight?(紡錘體圖）以消除卵母細(xì)胞暴露于紫外光。重要 的是去除每個(gè)卵母細(xì)胞中的第一極體，另外其可以在融合過程期間與卵母細(xì)胞融合。
[0176] B)體細(xì)胞轉(zhuǎn)移在卵黃周隙中
[0177] 1.在注射吸移管（12um直徑）中獲取3-4個(gè)供體細(xì)胞，排成一行。在此過程期間， 應(yīng)注意不破壞質(zhì)膜。
[0178] 2.在仙臺病毒包膜蛋白質(zhì)的小滴中排出供體細(xì)胞并再次獲取它們，每一細(xì)胞之間 的距離短（4-5個(gè)細(xì)胞長）。
[0179] 3.用保持吸移管保持卵母細(xì)胞。
[0180] 4.將具有供體細(xì)胞的注射吸移管推進(jìn)至卵母細(xì)胞中，不打破卵膜，并以核供體細(xì) 胞緊密地接觸卵膜的方式將一個(gè)核供體細(xì)胞輕輕地插入卵黃周隙中。
[0181] 5.在不干擾卵膜和供體細(xì)胞接觸下輕輕取出吸移管。
[0182] 6.對整個(gè)卵母細(xì)胞組完成此程序，并將其返回至培育箱中。
[0183] 7.供體細(xì)胞插入后10分鐘檢