用于急性髓細(xì)胞白血病(aml)的診斷、預(yù)后和治療的基于微rna的方法和組合物的制作方法
【專利說明】用于急性髓細(xì)胞白血病(AML)的診斷、預(yù)后和治療的基于微RNA的方法和組合物
[0001]本申請是以2008年1月29日提交的同名申請200880003736.7和201310439889.9的分別作為原始母案和直接母案的分案申請。
[0002]發(fā)明背景
[0003]急性髓細(xì)胞白血病(AML)是一種異質(zhì)病癥，它包括許多具有不同遺傳異常狀況和臨床特征的實(shí)體^已知相對少數(shù)類型的白血病的發(fā)病機(jī)理2。具有中等和差的危險(xiǎn)細(xì)胞遺傳學(xué)的患者代表大多數(shù)AML;基于化療的方案不能治愈這些患者中的大多數(shù)，干細(xì)胞移植經(jīng)常是治療選擇3 4ο由于同種異體干細(xì)胞移植不是許多高危白血病患者的選擇，迫切需要提高我們對這些白血病的生物學(xué)的理解和開發(fā)改良的療法。
[0004]AML中mRNA表達(dá)水平的系統(tǒng)性高通量分析，已經(jīng)描述了 AML的新的分子亞群；已經(jīng)提出，它們中的一些可預(yù)測結(jié)果5 6。盡管有該進(jìn)展，聚焦于已知的基因可能不足以揭示AML的分子難題。包括非編碼RNA的完整基因組方案的整合，可能提高對AML生物學(xué)的理解。
[0005]微RNA(microRNA，mi RNA)是長度為19-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其通過與部分或完全互補(bǔ)的位點(diǎn)進(jìn)行堿基配對來誘導(dǎo)翻譯抑制或切割它們的靶mRNA，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)7。miRNA參與關(guān)鍵的生物學(xué)過程，包括發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和增殖8。最近，已經(jīng)將miRNA表達(dá)與造血作用和癌癥相關(guān)聯(lián)9 n。Calin等人已經(jīng)證實(shí)了慢性淋巴細(xì)胞性白血病中miR-15a和miR-16-l的缺失和下調(diào)12。幾個(gè)研究組已經(jīng)報(bào)道了大細(xì)胞淋巴瘤13和小兒Burkitt淋巴瘤14中miRNA表達(dá)的變化。更近地，已經(jīng)證實(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞中miR-155的過表達(dá)導(dǎo)致多克隆B細(xì)胞增殖和B細(xì)胞瘤形成15。這些發(fā)現(xiàn)表明，miRNA參與人癌癥的起始和進(jìn)展。
[0006]如本文所公開的，使用miRNA微陣列來描繪一大組具有明顯中等和較差預(yù)后的AML患者，以研究miRNA譜與細(xì)胞遺傳組和臨床特征之間的關(guān)聯(lián)。
[0007]在急性髓細(xì)胞白血病癌細(xì)胞中差異表達(dá)的微RNA的鑒別，將輔助診斷、預(yù)知和治療白血病。此外，這些miRNA的推定靶的鑒別，將輔助解釋它們的致病作用。在一個(gè)主要方面，本文提供了用于急性髓細(xì)胞白血病的診斷、預(yù)后和治療的新的方法和組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明部分基于與正常對照細(xì)胞相比在乳腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA的急性髓細(xì)胞白血病癌癥特異性特征(signature)的鑒定。
[0009]因此，本發(fā)明包括診斷受試者是否患有急性髓細(xì)胞白血病(AML)或處于發(fā)展該疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，該方法包括測量來自所述受試者的受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物水平相比，受試樣品中miR基因產(chǎn)物水平的改變表示受試者患有AML或處于發(fā)展AML的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0010]在某些實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-29或miR-181。在某些實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-29b和/或miR_181b。
[0011]可使用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)測量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用RNA印跡分析測量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平低于對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平可高于對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
[0012]本發(fā)明還提供了診斷與受試者中一個(gè)或多個(gè)預(yù)后標(biāo)記關(guān)聯(lián)的AML的方法，該方法包括測量來自所述受試者的AML樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物水平相比，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平的改變表示受試者患有與一個(gè)或多個(gè)預(yù)后標(biāo)記關(guān)聯(lián)的AML。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣測量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，即通過逆轉(zhuǎn)錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；將所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供受試樣品的雜交譜；和，將受試樣品雜交譜與從對照樣品產(chǎn)生的雜交譜相比較來進(jìn)行測量。至少一種miRNA的信號的改變表示受試者患有AML或處于發(fā)展AML的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0013]本發(fā)明還包括治療受試者的CLL的方法，其中與從對照樣品產(chǎn)生的信號相比，至少一種miRNA的信號失調(diào)(例如，下調(diào)，上調(diào))。
[0014]在某些實(shí)施方案中，微陣列包含針對選自miR-29或miR-181和其組合的一種或多種miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸。
[0015]本發(fā)明還包括診斷受試者是否患有與受試者中一種或多種不利的預(yù)后標(biāo)記關(guān)聯(lián)的AML或處于發(fā)展該疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，即通過逆轉(zhuǎn)錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；將所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供所述受試樣品的雜交譜；和，將受試樣品雜交譜與從對照樣品產(chǎn)生的雜交譜相比較來進(jìn)行診斷。信號的改變表示受試者患有癌癥或處于發(fā)展癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0016]本發(fā)明還包括治療患有AML的受試者的AML的方法，其中，與對照細(xì)胞相比，受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物被下調(diào)或上調(diào)。當(dāng)至少一種miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中下調(diào)時(shí)，該方法包括對受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)至少一種miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中上調(diào)時(shí)，該方法包括對受試者施用有效量的至少一種用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖。在某些實(shí)施方案中，至少一種分離的miR基因產(chǎn)物選自miR-29、miR-181和其組合。
[0017]在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在受試者中治療AML的方法，該方法包括:測定與對照細(xì)胞相比，AML細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量；和如下改變AML細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量:如果癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量低于對照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，對受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物；或如果癌細(xì)胞中表達(dá)的m i R基因產(chǎn)物的量高于對照細(xì)胞中表達(dá)的m i R基因產(chǎn)物的量，對受試者施用有效量的至少一種用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖。在某些實(shí)施方案中，至少一種分離的miR基因產(chǎn)物選自miR-29、miR-181和其組合。
[0018]本發(fā)明還提供了用于治療AML的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物和藥學(xué)上可接受的載體。在具體的實(shí)施方案中，藥物組合物中至少一種分離的miR基因產(chǎn)物相應(yīng)于在AML細(xì)胞中下調(diào)(與合適的對照細(xì)胞相比)的miR基因產(chǎn)物。在具體的實(shí)施方案中，藥物組合物選自miR-29、miR-181和其組合。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種miR表達(dá)抑制劑化合物和藥學(xué)上可接受的載體。此外，在具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種特異于在AML細(xì)胞中上調(diào)(與合適的對照細(xì)胞相比)的miR基因產(chǎn)物的miR表達(dá)抑制劑化合物。
[0019]在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定抗AML試劑的方法，該方法包括對細(xì)胞提供受試試劑和測量與AML細(xì)胞中減少的表達(dá)水平關(guān)聯(lián)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與合適的對照細(xì)胞相比，細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的增加表示受試試劑為抗AML試劑。在某些實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自圖5-6，8-18和21 (表1_2，5-15和18)的任一個(gè)中所示的miRNA。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-20, miR-25, miR-191, miR-199a,和 miR_199b 和其組合。
[0020]本發(fā)明還提供了鑒定抗AML試劑的方法，該方法包括給細(xì)胞提供受試試劑和測量與AML細(xì)胞中增加的表達(dá)水平關(guān)聯(lián)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與合適的對照細(xì)胞相比，細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的減少表示受試試劑為抗AML試劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物選自miR-29、miR-181和其組合。
[0021]本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目的和特征將在下面的描述中予以部分闡述，且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在檢查下述內(nèi)容后其將部分地顯而易見，或可以從本發(fā)明的實(shí)踐中學(xué)習(xí)。如所附權(quán)利要求書特別指出的，可以實(shí)現(xiàn)和達(dá)到本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)。
[0022]附圖簡述
[0023]圖1A-F.通過qRT-PCR來定量成熟的miRNA，驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)。
[0024]圖1A.6個(gè)AML樣品相對于⑶34+祖細(xì)胞的微RNA (miRNA)表達(dá)。將結(jié)果表示為用let-71標(biāo)準(zhǔn)化(Ct)和2 Aet轉(zhuǎn)換18后AML樣品中的miRNA表達(dá)相對于⑶34+表達(dá)值的變化倍數(shù)(細(xì)條代表標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0025]圖1B.使用qRT-PCR驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)。散布圖顯示了每個(gè)樣品的miRNA微陣列表達(dá)值(21og)和標(biāo)準(zhǔn)化的qRT-PCR Oct值(對數(shù)尺度)之間的負(fù)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)R=0.88p〈0.001)。粉色實(shí)線代表預(yù)測的Y。qRT-PCR (Ct值)越低，miRNA的表達(dá)水平越高。例如，在底部右側(cè)的點(diǎn)具有低ACt值(高表達(dá))，且與高微陣列(芯片)值對應(yīng)。
[0026]圖1C.成熟的和造血定向的前體細(xì)胞中相對于⑶34+干細(xì)胞的MiRNA表達(dá)。將結(jié)果表示為用18S標(biāo)準(zhǔn)化和2吣轉(zhuǎn)換后不同成熟的和定向的前體細(xì)胞的平均miRNA表達(dá)相對于⑶34+細(xì)胞的表達(dá)的變化倍數(shù)。
[0027]圖1D.根據(jù)FAB分類分組的AML樣品中miR_181b的平均qRT-PCR表達(dá)；每個(gè)種類中患者樣品的數(shù)目如下:M0-M1 (6)，M2 (8)和M6M7 (5)。
[0028]圖1E.與其它異常核型(26)相比具有正常核型(10)的AML患者中的平均miR-10qRT-PCR 表達(dá)。
[0029]圖1F.通過qRT-PCR測得的具有復(fù)雜核型的患者(6)和具有其它細(xì)胞遺傳異常情況的患者(22)中miR-126的平均表達(dá)。使用t檢驗(yàn)(SPSS)，對比不同組之間的miRNA表達(dá)。
[0030]圖2A-D.新診斷的AML患者中與總存活率(overall survival)有關(guān)的微RNA。通過微陣列檢測的具有高或低miR-20 (圖2A)和miR-25 (圖2B)表達(dá)的122位AML患者的總存活率的Kaplan-Meier估計(jì)值。使用時(shí)序檢驗(yàn)(log-rank test)來對比存活曲線之間的差異。使用不同的技術(shù)(miRNA qRT-PCR)，使用具有類似臨床特征(圖4(表1))的36位AML患者的獨(dú)立組來驗(yàn)證miR-20和miR-25的結(jié)果預(yù)測力。顯示出通過qRT-PCR測得的具有高或低miR-20 (圖2C)和miR-25 (圖2D)表達(dá)的36位AML患者的總存活率的Kaplan-Meier估計(jì)值。通過Kaplan-Meier方法，得到具有95%置信區(qū)間(CI 95% )的危害比(hazardrat1)ο
[0031]圖3Α.從4位不同健康供體得到的骨髓紅細(xì)胞/巨核細(xì)胞前體和外周血成熟的粒細(xì)胞/單核細(xì)胞中的miR-181b和miR-135a的平均qRT-PCR表達(dá)。將結(jié)果表示為不同譜系中的miRNA表達(dá)相對于4種⑶34+細(xì)胞中miR_181b和miR_135b的表達(dá)的變化倍數(shù)。
[0032]圖3B.10位具有正常核型的患者和22位具有異常核型的患者中miR_30c的平均qRT-PCR表達(dá)值。使用t檢驗(yàn)(SPSS)，對比來自兩組(正常對異常核型)的miRNA表達(dá)值。
[0033]圖3C.在實(shí)現(xiàn)完全緩解(6)或誘導(dǎo)化療失敗(6)的具有新診斷的AML的12位獨(dú)立患者中，通過qRT-PCR測得的接受伊達(dá)比星和阿糖胞苷誘導(dǎo)化療的AML患者中的平均miR-29b表達(dá)。使用t檢驗(yàn)(SPSS)，對比來自兩組(完全緩解對失敗)的miRNA表達(dá)值。
[0034]圖4.表1.158位新診斷的AML患者的臨床和細(xì)胞遺傳學(xué)特征。
[0035]圖5.表2.與FAB分類和細(xì)胞遺傳學(xué)相關(guān)的微RNA。
[0036]圖6.表3.與122位AML患者中的總存活率相關(guān)的微RNA。
[0037]圖7.表4.用于微陣列數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化的持家基因探針。
[0038]圖8.表5.在⑶34+細(xì)胞和122位AML患者之間差異表達(dá)的MiRNA。
[0039]圖9 (表6).與其它AML FAB亞型相比在AML FAB M0-M1中差異表達(dá)的MiRNA。
[0040]圖10.表 7.在 AML FAB M3[t(15 ；17)]中差異表達(dá)的 MiRNA。
[0041]圖11.表8.與其它AML相比在AML FAB M4和M5中差異表達(dá)的MiRNA。
[0042]圖12.表9.與其它AML相比在AML FAB M6和M7中差異表達(dá)的MiRNA。
[0043]圖13.表10.與高WBC以及外周血(PB)和骨髓(BM)母細(xì)胞(blast)相關(guān)的MiRNA。
[0044]圖14.表11.與其它AML相比在正常核型AML中差異表達(dá)的MiRNA。
[0045]圖15.表12.與llq23重排相關(guān)的MiRNA。
[0046]圖16.表13.與非復(fù)雜的或正常的核型相比，在具有復(fù)雜核型的患者中差異表達(dá)的 MiRNA。
[0047]圖17.表14.與染色體7相關(guān)的MiRNA。
[0048]圖18.表15.與三體性8相關(guān)的MiRNA。
[0049]圖19.表16.最初誘導(dǎo)化療后首次復(fù)發(fā)或患有原發(fā)性難治病的54位AML患者的特征。
[0050]圖20.表17.用伊達(dá)比星和阿糖胞苷治療的24位患者的臨床特征。
[0051]圖21.表18.與對伊達(dá)比星和阿糖胞苷的響應(yīng)有關(guān)的MiRNA。
[0052]發(fā)明詳述
[0053]本發(fā)明部分地基于，與正常對照細(xì)胞相比在急性髓細(xì)胞白血病(AML)癌細(xì)胞中具有改變的表達(dá)的特定微RNA的鑒別，和這些微RNA與特定診斷、預(yù)后和治療特征的關(guān)聯(lián)。
[0054]如在本文中可互換使用的，“miR基因產(chǎn)物”、“微RNA”、“miR”或“miRNA”是指來自miR基因的未加工或已加工的RNA轉(zhuǎn)錄物。由于miR基因產(chǎn)物不翻譯成蛋白質(zhì)，因此術(shù)語“miR基因產(chǎn)物”不包括蛋白質(zhì)。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱為“miR前體”，其通常包括長度大約70-100個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物?？赏ㄟ^用RNA酶(例如，Dicer、Argonaut或RNA酶III (例如大腸桿菌RNA酶III))將其消化成具有活性的19至25個(gè)核苷酸的RNA分子來加工miR前體。該具有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也稱為“已加工的”miR基因轉(zhuǎn)錄物或“成熟的” miRNA。
[0055]可通過天然加工途徑(例如使用完整的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過合成加工途徑(例如使用分離的加工酶，例如分離的Dicer、Argonaut或RNA酶III)，從miR前體獲得具有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。應(yīng)理解，還可通過生物或化學(xué)合成(而不用從miR前體加工)，直接產(chǎn)生具有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。當(dāng)在本文中用名稱提及微RNA時(shí)，該名稱對應(yīng)著前體和成熟形式，除非另有說明。
[0056]本發(fā)明包括診斷受試者是否患有AML或處于發(fā)展AML的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，該方法包括測量來自受試者的受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平和將受試樣品中的miR基因產(chǎn)物水平與對照樣品中的相應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相比較。如本文所使用的，“受試者”可以是患有或懷疑患有AML的任何哺乳動物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是患有或懷疑患有AML的人。
[0057]可在從受試者獲得的生物樣品的細(xì)胞中，測量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可通過常規(guī)的活組織檢查技術(shù)，從懷疑患有AML的受試者中取出組織樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從受試者中取出血液樣品，并且可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離白細(xì)胞以用于DNA提取。優(yōu)選在開始放射療法、化學(xué)療法或其它療法之前從受試者獲得血液或組織樣品?？蓮氖茉囌叩奈词苡绊懙慕M織、從正常人個(gè)體或正常個(gè)體的群體或從相應(yīng)于受試者的樣品的大部分細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞獲得相應(yīng)的對照組織或血液樣品或?qū)φ諈⒄諛悠?。然后將對照組織或血液樣品與來自受試者的樣品一起進(jìn)行處理，以便可將從來自受試者的樣品的細(xì)胞中給定的miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來自對照樣品的細(xì)胞的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平進(jìn)行比較?？蛇x地，可以從受試樣品分開地得到和加工參照樣品(例如，在不同時(shí)間)，并且可以將從來自受試樣品的細(xì)胞中的給定的miR基因生成的miR基因產(chǎn)物的水平與來自參照樣品的相應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相對比。
[0058]在一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平高于對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“上調(diào)”)。如本文中所使用的，當(dāng)來自受試者的細(xì)胞或組織樣品中miR基因產(chǎn)物的量大于對照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)物的量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“上調(diào)”。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平低于對照樣品中相應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“下調(diào)”)。如本文中所使用的，當(dāng)從來自受試者的細(xì)胞或組織樣品中的該基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的量低于從對照細(xì)胞或組織樣品中的相同基因產(chǎn)生的量時(shí)，miR基因的表達(dá)“下調(diào)”?？筛鶕?jù)一個(gè)或多個(gè)RNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)確定對照和正常樣品中相對miR基因表達(dá)。所述標(biāo)準(zhǔn)可包括例如OmiR基因表達(dá)水平、標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的miR基因表達(dá)水平、受試者的未受影響的組織中的miR基因表達(dá)水平或之前從正常人對照群體獲得的miR基因表達(dá)的平均水平。
[0059]與對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，從受試者獲得的樣品中miR基因產(chǎn)物水平的改變(即增加或減少)，指示受試者中存在AML癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平高于對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平低于對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
[0060]在某個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自本文的表和圖中所示的組。
[0061]可使用適合用于檢測生物樣品中RNA表達(dá)水平的任何技術(shù)測量樣品中miR基因產(chǎn)物的水平。適用于測定生物樣品(例如，細(xì)胞，組織)中的RNA表達(dá)水平的技術(shù)(例如，RNA印跡分析、RT-PCR、原位雜交)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。在具體的實(shí)施方案中，使用RNA印跡分析檢測至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可通過在核酸提取緩沖液存在的情況下進(jìn)行勻漿，接著進(jìn)行離心來從細(xì)胞純化總的細(xì)胞RNA。沉淀核酸，然后通過用DNA酶處理和沉淀來除去DNA。然后按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在瓊脂糖凝膠上通過凝膠電泳分離RNA分子，并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾器。然后通過加熱將RNA固定在濾器上。使用適當(dāng)標(biāo)記的與所述RNA互補(bǔ)的DNA或RNA探針進(jìn)行特定RNA的檢測和定量。參見，例如，MolecularCloning:A Laboratory Manual, J.Sambrook 等人，e