糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多聚核苷酸的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物還可以是包含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、褐藻酸、角叉菜膠(carrageenan);胺化的多糖或低聚糖(線性或分支的)；或羧基化的多糖或低聚糖，例如與具有所得的羧基的連接的碳酸的衍生物反應(yīng)的多糖或低聚糖。優(yōu)選，調(diào)理作用-抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修飾的脂質(zhì)體有時稱為“PEG化脂質(zhì)體”。
[0136]可通過許多熟知的技術(shù)中的任一種將調(diào)理作用-抑制部分結(jié)合至脂質(zhì)體膜。例如，可將PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯與磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)可溶性錨結(jié)合，然后再與膜結(jié)合。類似地，可使用Na(CN)BH3和溶劑混合物(例如以30:12比例的四氫呋喃和水)在60°C下通過還原胺化作用，用硬脂酰胺脂質(zhì)可溶性錨衍生葡聚糖(dextran)聚合物。
[0137]用調(diào)理作用-抑制部分修飾的脂質(zhì)體在循環(huán)中比未修飾的脂質(zhì)體保持更長時間。因此，此類脂質(zhì)體有時稱為“隱形(stealth)”脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體在通過多孔或“滲漏”微脈管系統(tǒng)飼喂的組織中積累。因此，由此類微脈管系統(tǒng)缺陷表征的組織例如實體瘤(例如，AML癌)將有效地積累這些脂質(zhì)體；參見Gabizon，等人(1988), Proc.Natl.Acad.Sc1.，U.S.A.，18:6949-53。此外，減少的通過RES的吸收通過阻止脂質(zhì)體在肝和脾中的大量積累來降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用-抑制部分修飾的脂質(zhì)體特別適合用于將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至腫瘤細胞。
[0138]可在對受試者施用前，按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物配制為藥物組合物，有時稱為“藥劑”。因此，本發(fā)明包括用于治療AML癌的藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或分離的其變體或生物學(xué)活性片段和藥學(xué)上可接受的載體。在具體的實施方案中，該至少一種miR基因產(chǎn)物相應(yīng)于與適合的對照細胞相比在AML癌細胞中具有減少的表達水平的miR基因產(chǎn)物。
[0139]在其它實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括至少一種抑制miR表達的化合物。在具體的實施方案中，至少一種抑制miR基因表達的化合物特異于其在AML癌細胞中的表達高于對照細胞的miR基因。
[0140]本發(fā)明的藥物組合物表征為是至少無菌的和無熱原的。如本文中所使用的，“藥物組合物”包括用于人和獸醫(yī)用途的制劑。用于制備本發(fā)明的藥物組合物的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，例如在Remington’s Pharmaceutical Science,第17版，MackPublishing Company, Easton, PA.(1985)中所描述的，其全部分公開內(nèi)容通過引用合并入本文。
[0141]本藥物組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體混合的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物的序列的核酸)(例如，按重量計算0.1至90%)或其生理上可接受的鹽。在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物另外包含一種或多種抗癌劑(例如，化療劑)。本發(fā)明的藥物制劑還可包含由脂質(zhì)體封裝的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物的序列的核酸)和藥學(xué)上可接受的載體。在一個實施方案中，所述藥物組合物包含其不是miR-15，miR-16, miR-143和/或miR-145的miR基因或基因產(chǎn)物。
[0142]特別適合的藥學(xué)上可接受的載體是水、緩沖水溶液、常用鹽溶液、0.4%的鹽溶液、
0.3%的甘氨酸、透明質(zhì)酸等。
[0143]在具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含抗核酸酶降解的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物的序列的核酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以例如通過將一個或多個在2’ -位置被修飾的核糖核苷酸摻入miR基因產(chǎn)物來容易地合成具有核酸酶抗性的核酸。合適的2’ -修飾的核糖核苷酸包括在2’ -位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修飾的核糖核苷酸。
[0144]本發(fā)明的藥物組合物還可包含常規(guī)藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、重量摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)劑、緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括例如生理上生物相容性緩沖劑(例如，氨丁三醇鹽酸鹽)、螯合劑(例如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合絡(luò)合物(例如，鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)的添加或任選地，鈣或鈉鹽(例如，氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的添加。本發(fā)明的藥物組合物可以以液體形式包裝使用或可以進行凍干。
[0145]對于本發(fā)明的固體藥物組合物，可使用常規(guī)無毒性的固體的藥學(xué)上可接受的載體:例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。
[0146]例如，用于口服施用的固體藥物組合物可包含上文所列的任何載體和賦形劑以及10-95 %，優(yōu)選25 % -75 %的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可包含按重量計算0.01-20%，優(yōu)選1% -10%的封裝在上文所述的脂質(zhì)體中的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物的序列的核酸)和噴射劑。還可如所期望的包含載體例如卵磷脂以用于鼻內(nèi)遞送。
[0147]本發(fā)明的藥物組合物還可以包含一種或多種抗癌劑。在一個具體實施方案中，所述組合物包含至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物的序列的核酸)和至少一種化療劑。適用于本發(fā)明方法的化療劑包括、但不限于，DNA-烷化劑，抗腫瘤抗生素，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn)定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓撲異構(gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，HMG-CoA抑制劑，CDK抑制劑，細胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三螺旋DNA，核酸適配體，和分子上修飾的病毒、細菌和外毒素劑。適用于本發(fā)明組合物的試劑的實例包括、但不限于，胞苷阿拉伯糖苷，甲氨蝶呤，長春新堿，依托泊苷(VP-16),多柔比星(阿霉素)，順鉑(CDDP),地塞米松，arglabin，環(huán)磷酰胺，沙可來新，甲基亞硝脲，氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶(5FU)，長春堿，喜樹堿，放線菌素-D，絲裂霉素C，過氧化氫，奧沙利鉑，伊立替康，托泊替康，亞葉酸，卡莫司汀，鏈佐星，CPT-11，紫杉酚，他莫昔芬，達卡巴嗪，利妥昔單抗，柔紅霉素，l-β -D-阿糖呋喃糖胞嘧啶(l-β -D-arabinofuranosylcytosine),伊馬替尼，氣達拉濱，多西他賽和F0LF0X4。
[0148]本發(fā)明還包括鑒定抗AML癌試劑的方法，該方法包括給細胞提供受試試劑和測量細胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個實施方案中，該方法包括給細胞提供受試試劑和測量與AML癌細胞中減少的表達水平關(guān)聯(lián)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對照(例如，對照細胞中miR基因產(chǎn)物的水平)相比，細胞中miR基因產(chǎn)物水平的增加指示受試試劑為抗AML癌試劑。
[0149]在一個具體實施方案中，與AML癌細胞中降低的表達水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:圖5-6，8-18和21 (表1-2，5-15和18)的任一個中所示的miRNA和其組合。
[0150]在其它實施方案中，該方法包括給細胞提供受試試劑和測量與AML癌細胞中增加的表達水平關(guān)聯(lián)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對照(例如，對照細胞中miR基因產(chǎn)物的水平)相比，細胞中miR基因產(chǎn)物水平的降低指示受試試劑為抗AML癌試劑。[0151 ] 在一個具體實施方案中，與AML癌細胞中增加的表達水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-20，miR-25, miR-191, miR-199a5 和 miR_199b 和其組合。
[0152]合適的試劑包括但不限于藥物(例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白質(zhì)、核酸)。試劑可通過重組、合成產(chǎn)生，或其可從天然來源分離(即，純化)。用于給細胞提供此類試劑的各種方法(例如，轉(zhuǎn)染)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，并且在上文中描述了幾種此類方法。用于檢測至少一種miR基因產(chǎn)物的表達的方法(例如，RNA印跡、原位雜交、RT-PCR、表達譜分析)在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。本文也描述了這些方法中的幾種。
[0153]現(xiàn)將通過下列非限定性實施例來說明本發(fā)明。
實施例
[0154]方法
[0155]患者和細胞樣品。根據(jù)慣例指南(institut1nal guideline)簽署知情同意書后，從在MD Anderson Cancer Center 的 Cell and Tissue Bank (n = 202)和 Thomas JeffersonUniversity (n = 10)，得到158份來自新診斷的AML患者的白血病樣品和54份來自處于復(fù)發(fā)(34)或患有難治病(20)的AML患者的樣品(圖4(表1))。
[0156]收集骨髓或外周血樣品，通過Ficoll-Hypaque (Nygaard)梯度離心來制備，并冷藏保存。如前所述16，進行樣品的細胞遺傳分析。用于描述細胞遺傳克隆和核型的標準遵循人細胞遺傳命名法國際系統(tǒng)(Internat1nal System for Human CytogeneticNomenclature)的推薦17。使用36位AML患者的獨立組，使用qRT-PCR驗證微陣列內(nèi)的miRNA特征(圖4(表1))。通過骨髓抽吸物中〈5%的母細胞的存在、絕對外周嗜中性粒細胞數(shù)>1X1071和血小板>100x1071，定義完全緩解(cr)。
[0157]除了⑶34+(10位供體)以外，從Allcells購買外周血成熟粒細胞和單核細胞、骨髓CD71+選擇的紅細胞前體和來自4位健康供體的CD34+細胞。如前所述18，得到體外分化的巨核細胞。
[0158]RNA提取和miRNA微陣列實驗。
[0159]如別處詳細描述的19，進行RNA提取和miRNA微芯片實驗。簡而言之，使來自176位AML患者的5ug總RNA —式四份地與對應(yīng)于250個人成熟和前體miRNA的探針(如2005年 11 月 miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk)所述)20雜交。
[0160]微RNA的實時定量。
[0161]選擇如前所述21的使用PCR 9700 Thermocycler ABI Prism7900HT和序列檢測系統(tǒng)(Applied B1systems)的單管TaqMan miRNA，因為它在微陣列患者數(shù)據(jù)集合中具有最小的表達變異性。一式三份地進行對比實時PCR，包括無模板對照。使用比較(；方法，計算相對表達。
[0162]數(shù)據(jù)分析。
[0163]使用GENEPIX PRO分析微陣列圖像。當測得在至少10%樣品中存在時，將每個miRNA的重復(fù)點的平均值減去背景，進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，標準化，并保持在表達表中。針對印制在芯片上的散布于miRNA探針中的一組持家基因(圖7(表4))進行標準化。在兩類的對比(8口^034對41^)中，使用在微陣列顯著性分析(SAM)內(nèi)的檢驗程序22，鑒別出差異表達的miRNA。SAM在相對于所有測量的標準偏差的表達變化的基礎(chǔ)上，計算每個基因的評分。由于這是多重檢驗，進行排列來計算假發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate) (FDR)或q_值。將具有小于5%的FDR和超過2的變化倍數(shù)的MiRNA考慮用于進一步分析。使用MIAMExpress，將所有數(shù)據(jù)呈遞給Array Express數(shù)據(jù)庫(登記號未定)。
[0164]統(tǒng)計分析。
[0165]使用Fisher 精確檢驗(Fisher’s exact test)、t 檢驗和卡方檢驗(ch1-square)來對比患者組之間的基線特征和平均miRNA表達。所有報道的P值是雙側(cè)的并且通過使用SPSS軟件包(SPSS 10.0)得到。計算從診斷時直到最后一次隨訪時的總存活率，并計算從診斷時直到復(fù)發(fā)或死亡的無事件存活率(event-free survival) (EFS)。檢查在最后一次隨訪時存活的患者的數(shù)據(jù)。為了進行存活和建立Kaplan-Meier (KM)圖，通過將樣品分成2類(高和低表達，根據(jù)整組樣品中的中值(median)表達)，將通過qRT-PCR和在芯片上測量的miRNA水平轉(zhuǎn)化成離散變量。得到每個組的存活曲線，并通過使用時序檢驗進行對比。還報道了從KM方法得到的具有95 %置信區(qū)間的危害比。
[0166]靶預(yù)測和微陣列驗證
[0167]數(shù)據(jù)驗證。為了驗證微陣列數(shù)據(jù)，使用在10位患者中的42個miRNA測量，使用Pearson關(guān)聯(lián)和線性回歸分析(SPSS軟件)。這些函數(shù)檢查每對測量(一個來自芯片，另一個來自RT-PCR)，以確定兩個變量是否傾向于一起移動，即來自芯片的大r值(高表達)是否與來自qRT-PCR的低值(δ Ct)相關(guān)。預(yù)期負相關(guān)，因為qRT-PCR值(δ Ct)反比于miRNA的表達水平。使用芯片和qRT-PCR miRNA測量值的Log值。
[0168]革巴預(yù)測。使用TARGETSCAN32(www.genes, mit.edu/targetscan)和 PICTAR33(www.pictar.b1.nyu.edu)，在計算機上預(yù)測微RNA革E，所述兩個數(shù)據(jù)庫都預(yù)測保守的3’ UTRmiRNA 靶。
[0169]結(jié)果
[0170]AML患者顯示出與正常⑶34+祖細胞相比不同的miRNA表達譜。
[0171]作為理解miRNA在AML發(fā)病機理中的可能作用的第一步，我們使用miRNA微陣列平臺19，分析了 122個新診斷的AML患者樣品和來自10個不同供體的CD34+細胞中的miRNA表達(圖4 (表1)中的臨床數(shù)據(jù))。SAM僅鑒別出與CD34+細胞相比在AML樣品中下調(diào)的miRNA (表S2，支持信息)。我們使用qRT-PCR證實了許多這些差異表達的miRNA (圖1A)。另外，為了驗證微陣列平臺，我們對在芯片上高、中等和低表達的miRNA進行qRT-PCR。如圖1B所示，通過微陣列或qRT-PCR測得的miRNA水平非常一致，2個平臺的測量值之間存在非常顯著的關(guān)聯(lián)(r = 0.88，p〈0.001)。
[0172]miRNA特征與造血分化和FAB分類相關(guān)聯(lián)
[0173]已經(jīng)顯示，miRNA表達提示腫瘤的造血發(fā)育譜系和分化階段n。由于不同的譜表征AML患者中的正常和惡性細胞，我們通過qRT-PCR測定AML樣品和人造血細胞組(包括成熟的粒細胞和單核細胞，以及紅細胞和巨核細胞前體)中的CD34+細胞之間最差異表達的miRNA的表達模式。許多在AML中下調(diào)的miRNA也在成熟和前體造血細胞中下調(diào)(圖1C和3A)。2個近期的研究已經(jīng)描述了在⑶34+細胞體外分化成幾個譜系的過程中miRNA普遍下調(diào)18’23。這些結(jié)果暗示，白血病中miRNA的子集緊密遵循正常造血中miRNA表達的分化模式。如果miRNA反映白血病患者中的細胞分化階段，那么它們也應(yīng)與AML的法-美和英(FAB)分類相關(guān)24，所述分類基于細胞形態(tài)學(xué)和免疫表型，二者都與白血病的分化階段密切相關(guān)。實際上，我們鑒別出與FAB分類有關(guān)的特征(圖9-12，表6-9)。在FAB M0-M1內(nèi)，我們鑒別出幾個miR-181家族成員，以及在⑶34+細胞中高表達的其它miRNA，這暗示表達譜與干細胞的表達譜更接近(圖9(表6))。miR-181b的表達實際上在來自所有譜系的成熟的和定向的前體造血細胞中下調(diào)(圖3A)，并且在最分化的白血病如FAB M6-M7中觀察到類似的結(jié)果(圖1D)。
[0174]MiRNA與白細胞和母細胞計數(shù)正相關(guān)
[0175]我們?nèi)缓笱芯苛?miRNA是否與治療前患者特征例如年齡、性別、白細胞(WBC)計數(shù)、骨髓或外周血母細胞百分比相關(guān)。我們檢測到幾種miRNA(包括miR-155, miR-30b, miR-30c, miR-25和miR_181b)與白細胞計數(shù)、外周血和骨髓母細胞百分比正相關(guān)(圖13 (表10))。
[0176]微RNA特征與定義的細胞遺傳亞組相關(guān)。
[0177]為了鑒別與AML中的已知的細胞遺傳異常情況相關(guān)的miRNA，我們使用SAM內(nèi)的排列校正的t檢驗，研究了 116個AML樣品，所述樣品具有至少20個中期(通過常規(guī)核型分析)。這些數(shù)據(jù)總結(jié)在圖5(表2)中。
[0178]具有正常核型的AML。
[0179]我們鑒別出將具有正常核型的AML病例與具有異常核型的所有其它AML病例區(qū)分開的特征(圖14(表11)，圖3B)。在上調(diào)的基因中，miR位于Η0Χ基因簇內(nèi)，已經(jīng)證實其在具有正常核型6的AML中過表達(圖1E，圖5(表2))。更具體地，已經(jīng)證實，Hox內(nèi)含的miRNA如miR-10a和miR_196b革El向幾個Hox基因，這揭示該轉(zhuǎn)錄因子家族的復(fù)雜調(diào)節(jié)層18’ 25
ο
[0180]2項以前的研究鑒別出正常核型AML樣品中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因DNMT3A和3Β的高水平表達，這暗示異常甲基化在該亞型的發(fā)病機理中的潛在作用5 6。有趣地，在正常核型組的下調(diào)的miRNA中，存在預(yù)測靶向DNMT3A的2種miRNA (miR-200c和miR-182)和miR-(推測其靶向DNMT3B)。因而，這些miRNA的下調(diào)可能促成兩種DNMT3基因在正常核型AML細胞中的過表達。
[0181]llq23異常情況
[0182]在具有t(9 ;11) [5]和t(6 ;11) [4]的患者中下調(diào)的基因中(圖15 (表12))，預(yù)測許多基因靶向已經(jīng)描述成在該組患者中過表達且與預(yù)后不良有關(guān)的Hox基因，即H0XA9(let7f)，H0SA10 (iR-15a)，PBX3 (let07f, miR_15a 和 miR_196b)和 MEISI (miR-331)6 (圖 15 (表
12))o同樣地，預(yù)測在該組中也下調(diào)的miR-29家族的成員靶向抗細胞凋亡的MCLI基因。
[0183]復(fù)雜的核型
[0184]具有3種或更多種細胞遺傳學(xué)異常情況的樣品共有一個共同的特征，其包括miR-126、miR_26a、miR_34b、miR_30c和miR-301作為該組的最具差別的基因(圖16(表
13))。同樣地，在分離地缺失染色體7的患者中，miR-126被上調(diào)(表S11)。有趣地，該miRNA在⑶34+干細胞中高表達，且在其它AML(具有復(fù)雜核型的那些除外)中下調(diào)。使用qRT-PCR，在具有復(fù)雜(N = 6)和非復(fù)雜的細胞遺傳異常情況(N = 22)的AML患者獨立組中證實了這些結(jié)果(圖1F)。
[0185]三體性8
[0186]使用SAM得到的特征在具有分離的三體性8的患者樣品中鑒別出許多上調(diào)的m