對(duì)fmr1和fmr2基因5’非翻譯區(qū)進(jìn)行表征的pcr方法
【專利說(shuō)明】對(duì)FMRI和FMR2基因5'非翻譯區(qū)進(jìn)行表征的PCR方法
[000。 本申請(qǐng)是基于申請(qǐng)日為2010年2月16日，優(yōu)先權(quán)日為2009年3月24日，申請(qǐng)?zhí)?為201080032511. 1，發(fā)明名稱為"對(duì)FMRl和FMR2基因5'非翻譯區(qū)進(jìn)行表征的PCR方法" 的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[000引本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C. § 119(e)，要求2009年3月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng) 61/162,977 的權(quán)利。
[0004] 發(fā)明描述 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明屬于DNA合成與分析領(lǐng)域，特別是設(shè)及富含GC的模板和產(chǎn)物。
[0006] SM
[0007] 自從首次分離到DNA合成酶并確定了體外合成DNA的條件，DNA合成反應(yīng)已被廣 泛在生物技術(shù)、醫(yī)藥和研究應(yīng)用中用于制備和分析目的。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或PCR是可W快 速和指數(shù)性擴(kuò)增DNA序列的一類DNA合成反應(yīng)。與其他循環(huán)進(jìn)行的合成反應(yīng)一樣，PCR設(shè) 及W循環(huán)的方式反復(fù)拷貝祀序列。典型的PCR實(shí)施過(guò)程包括提供與待擴(kuò)增序列末端互補(bǔ)的 引物、合適的緩沖液、儀鹽、脫氧核巧S憐酸（dNTPs)和嗜熱DNA聚合酶。包含在例如基因 組DNA樣品中的模板或祀DNA與運(yùn)些成分在水溶液中接觸?；旌衔镌诓煌瑴囟冗M(jìn)行循環(huán)， 運(yùn)些溫度促進(jìn)模板的變性、引物與模板的退火、然后聚合酶對(duì)引物的延伸，從而產(chǎn)生更多 產(chǎn)物。由于每個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物可W在隨后的反應(yīng)中作為模板，產(chǎn)物的量幾乎指數(shù)增長(zhǎng)直至其 他反應(yīng)成分（開(kāi)始過(guò)量存在）被耗盡。參見(jiàn)例如美國(guó)專利4, 683, 202 ;M.J.Mc化erson&S. G.Moller,PCR=TheBasics^ndEd.，化71〇'&尸拘11。13)(2006)。
[0008] PCR與其他形式的循環(huán)進(jìn)行的核酸合成反應(yīng)對(duì)于分子生物學(xué)、生物技術(shù)、W及日漸 地對(duì)于醫(yī)學(xué)都是標(biāo)準(zhǔn)工具。PCR和相關(guān)技術(shù)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是快速、低成本、敏感度、可用于高通 量分析W及多能性。擴(kuò)增只需要幾小時(shí)甚至更短時(shí)間、少數(shù)的個(gè)別反應(yīng)可能只耗費(fèi)1美元 W下的試劑、需要的模板量通常在納克級(jí)別、自動(dòng)化使得每個(gè)機(jī)器人每天可W進(jìn)行幾千個(gè) 反應(yīng)，可W設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增幾乎任何序列的引物。
[0009] PCR及相關(guān)技術(shù)被廣泛用于分析和制備應(yīng)用。PCR的典型制備用途是用于擴(kuò)增序 列使它可W克隆到異源載體中。PCR重要的分析應(yīng)用包括設(shè)及具有大小多態(tài)性的基因座的 病情診斷或基因型確定。
[0010] 表現(xiàn)出醫(yī)學(xué)相關(guān)的大小多態(tài)性的基因座一個(gè)例子是，位于人X染色體上的FMRl基 因的5'非翻譯區(qū)扣TR)。正常個(gè)體的該區(qū)域內(nèi)通常有5-44個(gè)CGG重復(fù)。相反，含有200到 2000或更多個(gè)CGG重復(fù)的基因座等位基因指示著脆性X染色體綜合征（FX巧。運(yùn)種等位基 因被稱為全突變等位基因（化11Mutationalleles)。它們?cè)谶z傳學(xué)上不穩(wěn)定?；加蠪XS 的個(gè)體可能有諸如共濟(jì)失調(diào)、卵巢早衰、學(xué)習(xí)障礙和其他認(rèn)知/行為狀況（包括類自閉癥癥 狀）的癥狀的各種組合。
[0011] PCR多能性的一個(gè)令人遺憾的例外是難W擴(kuò)增富含GC序列的長(zhǎng)片段，包括 FMR15'UTR的全突變等位基因。對(duì)FMRIPCR進(jìn)行的優(yōu)化企圖包括對(duì)常規(guī)PCR方法條件的 改進(jìn)。參見(jiàn)GenomeRes. 6(7):633-8(1996);NucleicAcidsRes. 25(19):3957-8(1997); J.Mol.Diagn8:544-550(2006) Med.Genet. 51 (4) :527-34 (1994)。但是在FMRIPCR 方法發(fā)展了 15年多W后，即使最近的2008年（Genet.Med. 10(10) :714-9 (2008))，一篇發(fā)表 的關(guān)于檢測(cè)新生兒中脆性X染色體的試驗(yàn)性篩選研究仍報(bào)道說(shuō)"在確定女性中FMRl重復(fù)數(shù) 目的內(nèi)部驗(yàn)證過(guò)程中使用的…兩種定量鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)（PCR)分析方法未能產(chǎn)生可靠和 可重復(fù)的結(jié)果（粗體是后加的），此外"由初級(jí)或次級(jí)分離物進(jìn)行的二次PCR的失敗高度提 示FMR1CGG重復(fù)的異常大小"。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然把可重復(fù)地PCR擴(kuò)增全突變脆性 X染色體等位基因看作是有待解決的問(wèn)題。
[0012] 在通過(guò)PCR檢測(cè)含有超過(guò)100個(gè)重復(fù)的CGGS聯(lián)重復(fù)區(qū)時(shí)觀察到，隨著重復(fù)數(shù) 目的增加，檢測(cè)越來(lái)越弱（J.Mol.Dia即.7:605-12(2005))。運(yùn)一困難，結(jié)合FXS綜合征的 各不相同的特性，導(dǎo)致為了檢測(cè)全突變等位基因使用諸如Southern印跡的程序（同上）。 Southern印跡通常比PCR更耗時(shí)，成本更高，沒(méi)有PCR適合用于高通量應(yīng)用。
[0013]Tassone等（J.Mol.Dia即.10:43-49(2008);"Tassone2008")最近發(fā)表的文 章描述了用于不經(jīng)等位基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)較長(zhǎng)CGG等位基因的分析法。還可參見(jiàn) W02008/011170。該方法利用了與延展的CGG區(qū)內(nèi)的位點(diǎn)雜交的嵌合PCR引物，運(yùn)樣如果存 在寬的PCR產(chǎn)物彌散帶就表明延展等位基因陽(yáng)性（同上46頁(yè)）。
[0014] 隨機(jī)雜交策略可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增和分辨力不足。運(yùn)篇文章中使用的基礎(chǔ)PCR 條件已被多個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了檢驗(yàn)，似乎可W成功擴(kuò)增的CGG重復(fù)數(shù)目是大約350CGG重 復(fù)。參見(jiàn)例如Salutoetal.，J.Mol.Dia即.7:605-612 (2005)。Tassone2008 中的非特異 擴(kuò)增很明顯。Tassone2008圖1所示的瓊脂糖凝膠中的彌散帶似乎含有的產(chǎn)物超過(guò)了包 含350個(gè)重復(fù)的擴(kuò)增子的預(yù)期最大長(zhǎng)度，因此可能彌散帶大部分不代表CGG重復(fù)的特異產(chǎn) 物（參見(jiàn)化ssone2008的圖1 ;泳道5中的彌散帶似乎延伸到上樣孔內(nèi)的空間）。Tassone 等在圖3的圖標(biāo)中指出他們使用了Hi曲-LowIaddeHBionexus,Oakland,CA)作為分子量 標(biāo)記，圖1中的標(biāo)記似乎與圖3的相同?；?Lowladder中最大的條帶大約lOkb，而圖1 中的彌散帶超過(guò)了該條帶。運(yùn)一長(zhǎng)度也比分析中使用的樣品的預(yù)期全長(zhǎng)產(chǎn)物長(zhǎng)。列出的最 大等位基因大小是615個(gè)CGG重復(fù)。因此，通過(guò)給1845nt重復(fù)加上大約200nt旁側(cè)序列估 計(jì)出全長(zhǎng)產(chǎn)物預(yù)期大約沈b。非特異性產(chǎn)物會(huì)降低基于擴(kuò)增的脆性X染色體關(guān)聯(lián)等位基因 狀態(tài)的確定方法的準(zhǔn)確性和可信度。
[0015] 此外，用于檢測(cè)脆性X染色體的一些單純基于基因特異性引物設(shè)計(jì)的常規(guī)PCR方 法有局限性。例如，運(yùn)類方法根據(jù)PCR擴(kuò)增子的遷移率提供對(duì)CGG重復(fù)數(shù)目的一個(gè)估計(jì)。為 了能夠準(zhǔn)確地確定重復(fù)數(shù)目，通常相對(duì)外部校準(zhǔn)物（例如一組合適的分子量標(biāo)準(zhǔn)）來(lái)測(cè)量 擴(kuò)增子遷移率。能夠不依賴外部校準(zhǔn)物的情況下準(zhǔn)確確定CGG的數(shù)目將是可取的。
[0016] 而且，F(xiàn)MRl等位基因可能含有散布在CGG重復(fù)中的AGG序列，通常位于重復(fù)區(qū)段的 5'區(qū)域。對(duì)AGG序列元件的了解可W從一方面表征等位基因。AGG序列元件可W用于臨床 決策。例如注意到某個(gè)僅含有59個(gè)重復(fù)的FMRl等位基因，從母親到她的孩子中延展為全突 變等位基因的病例，并且已知該等位基因缺乏任何AGG元件。參見(jiàn)Nolinetal. ,Am.J.Hum. Genet. 72:454 - 464 (2003)。的確，全突變?nèi)绻麜?huì)，也是很少在第一批20個(gè)CGG重復(fù)之后含 有AGG元件，生物物理研究表明在CGG重復(fù)區(qū)段中帶有AGG"中斷者"的模板更可能采取更 常規(guī)的DNA結(jié)構(gòu)，更穩(wěn)定和易于被準(zhǔn)確地復(fù)制。參見(jiàn)例如Weisman-Shomer et al., Nucleic Acids Res.28:1535-41 (2000)；Zhong et al. , Am. J. Med. Genet.64:261-5(1996)； Larsen et al., Am. J. Med. Genet.93:99-106(2000);和Dombrowski et al., Hum. Mol. Genet.11:371-78(2002)。因此，需要對(duì)FMRl基因中諸如AGG元件的中斷元件進(jìn)行作圖的 技術(shù)。所W中斷元件作圖具有與脆性X染色體綜合征，W及其他重復(fù)相關(guān)疾病有關(guān)的研究 和診斷應(yīng)用。
[0017] 現(xiàn)有的AGG元件作圖方法包括測(cè)序和限制性酶切圖譜。DNA測(cè)序技術(shù)比較繁重，特 別是因?yàn)樵摷夹g(shù)通常需要對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行富集或分離（無(wú)論是體外或通過(guò)電腦模擬），在 脆性X染色體診斷測(cè)試中不是常規(guī)進(jìn)行的?；谙拗菩悦盖袌D譜的方法使用MnlI酶（酶識(shí) 別GAGG序列，在所述序列5'方向7個(gè)堿基對(duì)處切割）來(lái)根據(jù)包含F(xiàn)MR15'UTR中CGG重復(fù) 區(qū)的PCR產(chǎn)物被消化得到的片段大小來(lái)推測(cè)AGG的位置。參見(jiàn)例如Eichleretal.，化t. Genet. 8:88-94(1994);ZhongetHum.Genet. 57:351-361 (1995)。Eichler等 的方法包括重復(fù)區(qū)的PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、過(guò)夜酶切消化、電泳7小時(shí)W及Southern印跡。 在Zhong等的方法中，"將PCR產(chǎn)物用酪/氯仿提取一次，乙醇沉淀并在10升中用5單位 MnlI于 37°C部分消化 50-70 分鐘（thePCRproductwasextractedoncewithphenol/ chloroform,ethanolprecipit曰ted,曰ndpartiallydigestedinIOliterswithSunits at化r50-70min.)"(同上353頁(yè)）。之后進(jìn)行電泳和Southern印跡。運(yùn)兩種方法除了 PCR和電泳還設(shè)及多個(gè)步驟，包括純化/清理、限制酶切和Southern印跡。
[001引本文提供了方法對(duì)FMRl和FMR2基因的5'UTR中CGG重復(fù)進(jìn)行定量，W及中斷序 列的序列成分進(jìn)行鑒定、定量和掲示。本發(fā)明潛在的應(yīng)用包括給脆性X染色體測(cè)試的臨床 應(yīng)用。
[0019] 一些實(shí)施方案中，發(fā)明設(shè)及分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含 區(qū)的方法，所述方法包括：
[0020] (a)提供至少兩個(gè)不同引物，包括含有CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重復(fù)的第一 引物訊與CGG富含區(qū)之外的位點(diǎn)退火的第二引物；
[0021] 化）用所述至少兩個(gè)不同引物和包含至少一種CGG富含區(qū)的至少一種模板進(jìn)行 PCR，其中所述PCR產(chǎn)生一組產(chǎn)物；
[0022] (C)利用分辨率高的技術(shù)將產(chǎn)物分開(kāi)，產(chǎn)生產(chǎn)物大小和豐度的表現(xiàn)形式 (representation);從及
[0023] (d)得出關(guān)于所述至少一種CGG富含區(qū)中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所 述至少一種CGG富含區(qū)中處于何處的信息。
[0024] -些實(shí)施方案中，發(fā)明設(shè)及分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含 區(qū)的方法，所述方法包括：
[00巧](a)提供至少S種不同引物，包括含有CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重復(fù)和5'側(cè) 翼（flap)的第一引物；與CGG富含區(qū)之外的位點(diǎn)退火的第二引物；和具有第一引物的5'側(cè) 翼所包含的序列的第=引物，其中第一引物提供的濃度低于第=引物；
[0026] 化）用所述至少S種不同引物和所述至少一種模板進(jìn)行PCR，其中所述PCR產(chǎn)生一 組產(chǎn)物；
[0027] (C)利用分辨率高的技術(shù)將產(chǎn)物分開(kāi)，產(chǎn)生產(chǎn)物大小和豐度的表現(xiàn)形式；W及
[0028] (d)由上述表現(xiàn)形式得出關(guān)于所述至少一種CGG富含區(qū)中是否存在中斷序列，或 者中斷序列在所述至少一種CGG富含區(qū)中處于何處的信息。
[0029] 一些實(shí)施方案中，發(fā)明設(shè)及分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含 區(qū)的方法，所述方法包括：
[0030] (a)提供兩種不同引物，其中第一引物含有CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重復(fù)； 第二引物與CGG富含區(qū)之外的位點(diǎn)退火；
[0031] 化）用所述至少兩種不同引物和包含CGG富含區(qū)的模板進(jìn)行PCR，其中所述PCR產(chǎn) 生一組產(chǎn)物；
[0032] (C)利用分辨率高的技術(shù)將產(chǎn)物分開(kāi)，產(chǎn)生產(chǎn)物大小和豐度的表現(xiàn)形式；W及
[0033] (d)由所述表現(xiàn)形式得出關(guān)于CGG重復(fù)數(shù)目的信息。
[0034] 一些實(shí)施方案中，發(fā)明設(shè)及分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含 區(qū)的方法，所述方法包括：
[003引 （a)提供S種不同引物，其中第一引物含有〔66、0^、6〔6、〔6(：、00：或660重復(fù)和 5'側(cè)翼；第二引物與CGG富含區(qū)之外的位點(diǎn)退火；第S引物具有第一引物的5'側(cè)翼所包含 的序列；
[0036] 化）用所述S種不同引物和包含CGG富含區(qū)的模板進(jìn)行PCR，其中所述PCR產(chǎn)生一 組產(chǎn)物；
[0037] (C)利用分辨率高的技術(shù)將產(chǎn)物分開(kāi)，產(chǎn)生產(chǎn)物大小和豐度的表現(xiàn)形式；W及
[0038] (d)由所述表現(xiàn)形式得出關(guān)于CGG重復(fù)數(shù)目的信息。
[0039] 一些實(shí)施方案中，發(fā)明設(shè)及包含選自SEQIDNO:44和SEQIDNO:45的序列的寡 核巧酸。
[0040] 應(yīng)當(dāng)理解，如權(quán)利要求，W上概述和下面的詳述僅用于示范和解釋，不是對(duì)發(fā)明的 限制。
[00川發(fā)明詳述
[0042] 發(fā)明設(shè)及擴(kuò)增CGG重復(fù)區(qū)全部或部分的擴(kuò)增反應(yīng)。一些實(shí)施方案中，CGG重復(fù)區(qū) 包含在FMRl的5'UTR或FMR2的5'UTR中。
[0043] 發(fā)明設(shè)及運(yùn)樣的擴(kuò)增反應(yīng)，所述反應(yīng)使用與CGG重復(fù)區(qū)W外退火的引物，和與CGG 重復(fù)序列、序列的序列置換或反向互補(bǔ)佑〔6、〇^、〔6(：、6〇：或660退火的引物。與〔66重 復(fù)區(qū)W外（上游或下游）退火的引物可W是正向或反向引物。引物可W與CGG重復(fù)區(qū)旁側(cè) 的序列退火。運(yùn)類正向引物的例子包括CGGTGGAGGGCCGCCTCTGAGC(沈QIDNO: 1)、 CAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTT(沈QIDNO:2)、CAGTCAGGCGCTCAGCTCCGTTTC G(沈QIDNO:3)、TCCGGTGGAGGGCCGCCTCTGAGC(SEQIDNO:4)、GGTTCGGCCTCAGTC AGGCGCTCAGCTCCGTTTCG(SEQIDNO:5)、GGGTTCGGCCTCAGTCAGGCGCTCAGCTCC GTTTCG(SEQIDNO:6)、GCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCAGTCA(SEQIDNO:7)、CAGCGG GCCGGGGGTTCGGCCTCAG(沈QIDNO:8)、GCAGCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCA(SEQID NO:9)、GGGCCGGGGGTTCGGCCTCAGTCAG(沈QIDNO:10)、GGGGTTCGGCCTCAGTCA GGCGCTCA(SEQIDNO:11)、GGGGTTCGGCCTCAGTCAGGCGCTCAG(沈QIDNO:12)、GGC GCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC(沈QIDNO: 13)、TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTC GGTTTCA(沈QIDNO: 14)、CACTTCCGGTGGAGGGCCGCCTCTGA(SEQIDNO:巧）、TTC CGGTGGAGGGCCGCCTCTGAGC(沈QIDNO:16)和TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGT TTCACGGCGGCGGCGGCGGA(SEQIDNO:44)。運(yùn)類反向引物的例子包括CGCACTTCCACC ACCAGCTCCTCCA(SEQIDNO:17)、GGAGCCCGCCCCCGAGAGGTG(沈QIDNO:18)、GGG AGCCCGCCCCCGAGAGGT(沈QIDNO: 19)、CGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCAT(SEQ IDNO:20)、CGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGTG(沈QIDNO:21)、CCGGGAGCCCGCCCCCGA GAGGT(沈QIDNO:22)、CCGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGTG(SEQIDNO:23)、CGCCGGGAG CCCGCCCCCGAGAGGTG(沈QIDNO:24)、GCGCCGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGT(沈QID NO:25)、CGCCGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGT(沈QIDNO:26)、GCGCCATTGGAGCCCCGC ACTTCCACCA(SEQIDNO: 27)、GCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCA(SEQIDNO: 28)、 AGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC(沈QIDNO:29)、CGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCA C(沈QIDNO:30)、TTGGAGCCCCGCACTTCCACCACCA(沈QIDNO:31)、AGCCCCGCACTT CCACCACCAGCTCCT"SEQIDNO:3。、GAGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCT(SEQID N0:33)、CATTGGAGCCCCGCACTTCCACCACCAG(SEQIDNO:34)、CCCGCACTTCCACCA CCAGCTCCTCCATCT(沈QIDNO:35)、TAGAAAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC(沈Q IDNO:36)、AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC(沈QIDNO:37)、AAGCGCCATTGGAGC CCCGCACTTCCCCGCCGCCGCCGCCG(SEQIDNO:43)和AAGCGCCATTGGAGCCCCGCA CTTCCCCGCCGCCGCCGCCT(沈QIDNO:4巧。
[0044] 發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及方法及其用途，包括提供引物TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCAC TTCCGGT(沈QIDN0:38)、AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCCGCCGCCGCCG(SEQIDN0:39)、TCA GGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA(SEQIDN0:40)和TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA CGGCGGCGGCGGCGG(SEQIDN0:41)。發(fā)明還設(shè)及包含沈QIDNOs1-38 或 40 之一并在 3' 端附加CGG重復(fù)或其置換和反轉(zhuǎn)序列的引物。發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及包括提供引物的方法及其用 途，所述引物含有多個(gè)序列CGG的=核巧酸重復(fù)或其置換和反轉(zhuǎn)序列。在一些實(shí)施方案中， 引物中的CGG重復(fù)數(shù)量是四個(gè)或五個(gè)。在一些實(shí)施方案中，引物含有12-15個(gè)核巧酸的S 核巧酸重復(fù)序列。在一些實(shí)施方案中，引物含有從3個(gè)到10個(gè)的多個(gè)重復(fù)。引物可能含有 3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)重復(fù)，和任選的1或2個(gè)0和/或0殘基的其他部分重復(fù)。還可^ 提供其他引物來(lái)保證例如多態(tài)位點(diǎn)的結(jié)合，或者用于擴(kuò)增大小已知區(qū)域作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
[0045] 在一些實(shí)施方案中，與CGG重復(fù)序列退火的引物對(duì)包含中斷元件的CGG富含區(qū)內(nèi) 的位點(diǎn)優(yōu)先結(jié)合。與CGG重復(fù)序列退火的引物優(yōu)先結(jié)合至少一種包含中斷元件的位點(diǎn)，通 過(guò)例如在PCR反應(yīng)中使用該引物和如上所述與CGG富含區(qū)之外結(jié)合的反向第二引物，會(huì)導(dǎo) 致選擇性擴(kuò)增包含所述中斷元件的至少一種產(chǎn)物。優(yōu)先結(jié)合活性可W是對(duì)包含CGG和AGG 元件的位點(diǎn)，或者它們的置換和/或反轉(zhuǎn)序列特異的，比如包含（1) 一個(gè)AGG元件或者包含 A的部分AGG元件，W及（2)=、四、五、或六個(gè)CGG元件和任選的部分CGG元件的位點(diǎn)。
[0046] 優(yōu)先結(jié)合的程度，表達(dá)為使用所述引物和結(jié)合到CGG富含區(qū)之外的反向第二引物 進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)中被選擇性擴(kuò)增的產(chǎn)物與背景產(chǎn)物的比率，可W是至少3倍、4倍、5倍或6 倍；或者可W在3-12倍、3-10倍、3-8倍、4-12倍、4-10倍、4-8倍、3-7倍、4-7倍、3-6倍或 4-6倍的范圍內(nèi)。所述至少一種被選擇性擴(kuò)增的產(chǎn)物通常其長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)沿著模板從與包含中 斷元件的位點(diǎn)優(yōu)先結(jié)合時(shí)第一引物的5'端到與CGG富含區(qū)之外位點(diǎn)結(jié)合時(shí)第二引物的5' 端之間的距離。
[0047] -些實(shí)施方案中，與CGG重復(fù)序列退火并優(yōu)先結(jié)合包含中斷元件的CGG富含區(qū)內(nèi) 的位點(diǎn)的引物可能在與CGG重復(fù)序列退火的引物部分的內(nèi)部或者末端含有A、T或U殘基， 或者換句話說(shuō)，在CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重復(fù)之中或者末端含有A、T或U殘基；參 見(jiàn)例如W上SEQIDNOs44和45。A、T或U殘基可W發(fā)生在引物的3'端。當(dāng)A、T或U殘 基發(fā)生在CGG、CCG、GCG、CGC或GCC、GGC重復(fù)的末端時(shí)，A、T或U殘基與最后一個(gè)完整CGG、 CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重復(fù)之間可能有也可能沒(méi)有部分CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC 重復(fù)。如下文更詳細(xì)的描述，可W用非天然核巧酸殘基代替A、T或U殘基，所述非天然核巧 酸殘基比其他天然核巧酸殘基更優(yōu)先與T/U或A殘基配對(duì)。類似地，也可能用一或多個(gè)比其 他天然核巧酸殘基更優(yōu)先與C或G殘基配對(duì)的非天然核巧酸殘基代替構(gòu)成CGG、CCG、GCG、 CGC、GCC或GGC重復(fù)的一或多個(gè)G和/或C。在本來(lái)是由CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重 復(fù)（任選含有A、T、U或如上討論的相應(yīng)的非天然殘基）構(gòu)成的序列中存在一或多個(gè)運(yùn)種非 天然殘基不影響所述序列在本發(fā)明公開(kāi)中被認(rèn)為是CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重復(fù)序 列。
[0048] 在非錯(cuò)定分析法中，提供的第一引物對(duì)不包含中斷元件的CGG富含區(qū)有優(yōu)先結(jié)合 活性。在非錯(cuò)定方法結(jié)果中，較低水平的產(chǎn)物表明存在著中斷元件，因?yàn)檫\(yùn)些產(chǎn)物的合成設(shè) 及第一引物結(jié)合到包含中斷元件的位點(diǎn)上并延伸。低水平的產(chǎn)物在電泳圖中顯示為缺口或 者被較高峰包圍的低峰。
[0049] 在錯(cuò)定分析法中，提供的第一引物對(duì)包含中斷元件的CGG富含區(qū)有優(yōu)先結(jié)合活 性。應(yīng)當(dāng)注意，可W給運(yùn)樣的反應(yīng)提供對(duì)包含中斷元件的CGG富含區(qū)內(nèi)的位點(diǎn)有優(yōu)先結(jié)合 活性的引物，所述反應(yīng)其中的至少一種模板包含至少一種含有〇、1或復(fù)數(shù)個(gè)中斷元件的 CGG富含區(qū)；引物"對(duì)包含中斷元件的CGG富含區(qū)有優(yōu)先結(jié)合活性"的說(shuō)法并不表示例如CGG 富含區(qū)一定包含復(fù)數(shù)個(gè)中斷元件。錯(cuò)定分析法中，較高水平的產(chǎn)物表明存在著中斷元件，因 為運(yùn)些產(chǎn)物的合成設(shè)及第一引物與包含中斷元件的位點(diǎn)結(jié)合并延伸。高水平產(chǎn)物可能在電 泳圖中顯示為被低峰