和/或基線信號(hào)包圍的峰尖。
[0050] -些實(shí)施方案中，錯(cuò)定分析法中使用的第一引物在CGG重復(fù)之中或者3'端包含A、 T或U殘基。一些實(shí)施方案中，錯(cuò)定分析法中使用的第一引物包含比其他天然核巧酸殘基更 容易與A或T/U殘基配對(duì)的非天然核巧酸殘基。非天然核巧酸殘基是包含腺嚷嶺、胸腺喀 晚、鳥嚷嶺、胞喀晚和尿喀晚（分別是A、T、G、C和U)之外的核巧堿基的核巧酸殘基。優(yōu)先 與A或T/U殘基配對(duì)的非天然核巧酸殘基的例子包括，但不限于比其他天然殘基更易于與 A或T/U配對(duì)的T、U或A的加合物（例如5-取代的尿喀晚類似物）；和包含諸如例如假尿 喀晚和二氨基嚷嶺的核巧堿基的殘基。
[0051] 兩種引物與雙鏈核酸模板的相反兩鏈結(jié)合時(shí)，它們被認(rèn)為是反向的引物。
[0052] 本文中，當(dāng)序列發(fā)生在包含CGG重復(fù)的鏈中CGG富含區(qū)的5'方向時(shí)，序列是CGG 富含區(qū)的上游。本文中，當(dāng)序列發(fā)生在包含CGG重復(fù)的鏈中CGG富含區(qū)的3'方向時(shí)，序列 是CGG富含區(qū)的下游。
[0053] 本發(fā)明的方法可能設(shè)及包括提供至少兩種或至少=種不同引物的擴(kuò)增反應(yīng)。在一 些實(shí)施方案中，提供了至少=種不同引物，其中的一種引物是另一引物的亞序列。在一些實(shí) 施方案中，一個(gè)引物是包含CGG重復(fù)和5'側(cè)翼序列的嵌合引物，另一個(gè)引物具有嵌合引物 5'側(cè)翼序列的序列。應(yīng)當(dāng)注意，具有嵌合引物5'側(cè)翼序列之序列的引物可W，但不必須具 有嵌合引物的全部非重復(fù)序列。換句話說，一個(gè)引物的部分或全部序列可W由另一個(gè)引物 的序列構(gòu)成；例如，嵌合引物包含5'側(cè)翼序列，另一個(gè)引物可W包含部分或全部5'側(cè)翼的 序列。在一些實(shí)施方案中，引物含有12-15個(gè)核巧酸的CGG重復(fù)序列。5'側(cè)翼序列可能對(duì) 應(yīng)與CGG重復(fù)區(qū)相鄰或靠近的序列，或者與CGG重復(fù)區(qū)內(nèi)的和周圍的序列無關(guān)。在一些實(shí) 施方案中，嵌合引物的長度大約是35、40、45、50或5511*。在一些實(shí)施方案中，一或多種引物 的Tm在60°C-75°C的范圍內(nèi)，例如大約60°C、65°C、70°C或75°C。
[0054] -些實(shí)施方案中，提供了至少=種不同引物，其中一種引物提供的濃度低于另一 種引物的濃度。例如，任選提供的嵌合引物濃度低于具有嵌合引物5'側(cè)翼序列之序列的 引物的濃度。濃度的比率，W倍數(shù)表示，可能在2-10, 000或更大的范圍內(nèi)，例如是10、20、 50、100、200、500、1，000、2, 000、5, 000或10, 000。運(yùn)種實(shí)施方案中，處于較低濃度的引物可 W在擴(kuò)增反應(yīng)早期的幾輪中被耗盡，因此延伸通常全部或者幾乎全部來自仍然存在的引物 (開始處于較高濃度）。
[005引本發(fā)明設(shè)及擴(kuò)增核酸的反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)的例子包括，但不限于PCR、NASBA(基 于核酸序列性擴(kuò)增）和SDA(鏈置換擴(kuò)增）。參見例如美國專利4, 683, 202(PCR);美 國專利 6, 326, 173J.OfVirol.Methods151:283-293 (2008) (NASBA) ;W及美國專利 5, 648, 211 (SDA)。W上文獻(xiàn)均通過引用并入本文。技術(shù)人員知道適合提供何種試劑。運(yùn)些 方法每一種都設(shè)及在有助于DNA聚合發(fā)生和含有模板的溶液中進(jìn)行DNA的合成，因此設(shè)及 使用DNA聚合酶、核巧酸和二價(jià)陽離子（W鹽提供，特別是儀）。運(yùn)些方法的不同在于提供 其他的催化活性、使用熱循環(huán)溫育或等溫溫育W及引物的使用和結(jié)構(gòu)。通常還要提供合適 抑的緩沖液，比如抑7和8、6. 5和8. 5、6和9之間，或者大約7. 4或7. 5。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的PCR，至少提供一對(duì)與相反兩鏈的末端或者目標(biāo)區(qū)域結(jié)合的引物，運(yùn) 樣它們各自引導(dǎo)朝向另一引物的合成。反應(yīng)在不同溫度循環(huán)從而推動(dòng)高溫下底物變性步 驟、低溫下引物退火步驟，W及在可能但不一定比退火步驟的溫度高的溫度下進(jìn)行延伸。由 于一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物可W在下個(gè)循環(huán)中作為底物，發(fā)生擴(kuò)增。
[0057]在NASBA中，除了DNA聚合酶，還提供RNA聚合酶（RNAP)，后者也可能是逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT)(例如，可W利用RNA或DNA模板催化DNA合成的酶）。提供的引物類似于PCR中使用 的那些，但至少一種引物還包含RNAP可W識(shí)別的啟動(dòng)子序列。因此，RT的產(chǎn)物作為RNAP的 模板，而RNAP合成RNA作為RT的模板，從而發(fā)生擴(kuò)增。一些形式的NASBA中，提供RNaseH 在通過RT合成了RNA-DNA雜交體后產(chǎn)生單鏈DNA。通過RT和RNAP的聯(lián)合作用，在不需要 反復(fù)熱變性的情況下進(jìn)行擴(kuò)增。
[0058]SDA技術(shù)中W等溫和異步方式進(jìn)行DNA擴(kuò)增，意味著不是利用循環(huán)式熱變性來分 開兩條鏈的，而是通過DNA合成本身進(jìn)行鏈置換，其中3'OH的延伸導(dǎo)致下游鏈被置換。3'OH 先是由外部引物提供，然后通過切口反應(yīng)提供。需要提供兩對(duì)引物。'內(nèi)部'的一對(duì)引物與 擴(kuò)增子周圍結(jié)合，并且包含含有限制性酶切位點(diǎn)的5'側(cè)翼。另一對(duì)"外部"引物定位在遠(yuǎn) 偵U，即離目標(biāo)區(qū)域更遠(yuǎn)。內(nèi)部引物可W與模板結(jié)合，被延伸，然后被相應(yīng)外部引物的合成所 置換。之后，發(fā)生置換的DNA通過例如第二鏈合成成為雙鏈。下一步是將雙鏈分子的一條鏈 切口，運(yùn)可W通過使用經(jīng)修飾的核巧酸和限制酶切位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)，其中一條鏈（而非另一條 鏈）上的所述切割位點(diǎn)由于修飾核巧酸而失活。反應(yīng)中提供了與該位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切 酶，從而生成切口。所得到的切口處的3'OH被DNA聚合酶延伸，將一條鏈（可W再作為模 板：要注意，一些展示的鏈并非最初是全長，但由于形成切口，內(nèi)部引物帽的遠(yuǎn)端缺乏互補(bǔ)。 運(yùn)不會(huì)削弱引物結(jié)合（該引物的非帽部分具有足W穩(wěn)定退火的長度）且，通過引物結(jié)合，產(chǎn) 生5'突出端，使聚合酶能進(jìn)行填充）置換，重新形成的雙鏈分子再次成為切口反應(yīng)的底物， 然后被延伸和置換，導(dǎo)致擴(kuò)增發(fā)生。過程中不需要進(jìn)行反復(fù)熱變性。
[0059] -些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括提供GC/AT比率大于1并且總dNTP濃度有助 于利用富含GC的模板來合成DNA的dNTPs。參見美國專利申請(qǐng)12/371，306。GC/AT比率可 U是大約 1. 1、1. 2、1. 4、1. 6、2、2. 5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 25 或更高。GC/AT比率可W在 1. 1 和 20、1. 1 和 15、1. 1 和 10、1. 1 和 8、1 和 15、1. 1 和 7、 1.1和6、1.1和5、1.2和25、1.4和25、1.6和25、2和25、3和25、4和25、5和25、2和15、 2. 5 和 10,或者 4 和 10 之間?？俤NTP濃度可W是大約 0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1、1. 2、 1. 5、2 或 3mM。dNTP濃度可W在 0. 4 和 3mM、0. 5 和 3mM、0. 6 和 3mM、0. 7 和 3mM、0. 8 和 3mM、 0. 9 和 3mM、l和 3mM、0. 4 和 2mM、0. 4 和 1. 5mM、0. 4 和 1. 2mM、0. 4 和lmM、0. 4 和 0. 9mM、0. 4 和 0. 8mM、0. 4 和 0. 7mM、0. 5 和 2mM、0. 5 和ImM,或者 0. 6 和 0. 9mM之間。"GC/AT比率"意味著 給定溶液或混合物中，dCTP、dGTP及其所有核巧酸類似物的總濃度與dATP、dTTP、加TP及其 所有核巧酸類似物的總濃度的比率。"dNTP"代表脫氧核巧S憐酸，是指dATP、dCTP、dGTP、 dTTP、加TP及其類似物。"核巧酸類似物"是包含天然堿基腺嚷嶺（A)、胞喀晚（C)、鳥嚷嶺 (G)、胸腺喀晚（T)或尿喀晚扣）之外的堿基部分、與脫氧核糖相同或類似的糖部分、W及至 少一種憐酸或多個(gè)憐酸（例如二憐酸或=憐酸）部分的分子或離子。核巧酸類似物是特定 核巧酸（特別是dATP、dCTP、dGTP、dTTP或加TP)的類似物，當(dāng)它包含結(jié)構(gòu)和構(gòu)型都適合通 過聚合酶引入核酸雙螺旋的=憐酸和糖部分，W及運(yùn)樣的堿基時(shí)，所述堿基在核酸雙螺旋 中的堿基配對(duì)特性和被DNA聚合酶引入核酸雙螺旋的位點(diǎn)與W上列舉的5種核巧酸之一非 常類似，除了dTTP的類似物通常也是加TP的類似物，反之亦然。與包括但不限于"核巧"、 "堿基"、"核巧堿基"或"殘基"等名詞關(guān)聯(lián)使用的名詞"類似物"應(yīng)當(dāng)按照和與"核巧酸"關(guān) 聯(lián)時(shí)同樣方式地解釋。
[0060] 一些實(shí)施方案中，可W提供強(qiáng)化劑。強(qiáng)化劑有助于成功進(jìn)行產(chǎn)生富含GC的產(chǎn)物 的反應(yīng)。PCR反應(yīng)中通?？蒞包括多種強(qiáng)化劑來提供產(chǎn)量、特異性和一致性，并且可能是通 過降低模板DNA的Tm來實(shí)現(xiàn)。強(qiáng)化劑可能通過螺旋去穩(wěn)定、反應(yīng)抑制劑中和或其他機(jī)理， 包括未知機(jī)理來發(fā)揮作用。強(qiáng)化劑包括，但不限于甜菜堿、甜菜堿類似物、甘油、牛血清白 蛋白度SA)、聚乙二醇、氯化四甲胺、7-脫氧-GTP、中性去污劑、二甲基亞諷值MS0)、甲醇、 乙醇、異丙醇、甲酯胺、丙酬、乙酷胺、N-甲基甲酯胺、N，N-二甲基甲酯胺、丙酬、乙酷甲胺、 N-甲基乙酷甲胺、N，N-二甲基乙酷甲胺、2-化咯燒酬、N-甲基化咯燒酬、丙酷胺和異下締 胺。中性去污劑包括，但不限于TWEEN-20、0-辛基-葡萄糖巧、辛基-0-硫-化喃葡萄 糖巧、TritonX-100、TritonX-114、NP-40、化ij-35、化ij-58、Tween-80、PluronicF-68、 PluronicF-127、脫氧BigCHAP、CHAPS、CHES、壬基苯氧基聚乙氧乙醇燈ergito^type NP-40)和辛基苯氧基聚乙氧乙醇（IgepalCA-630)。甜菜堿類似物包括，但不限于同型丹醇 (homodeanol)甜菜堿、丹醇甜菜堿、丙酸甜菜堿、同型甘油甜菜堿、二乙醇同型甜菜堿、S乙 醇同型甜菜堿、徑丙基同型甜菜堿、N-甲基-N-(2-簇乙基）嗎嘟內(nèi)鹽、N-甲基-N-(2-簇乙 基）贓晚內(nèi)鹽、N-甲基-N-(2-簇乙基）化咯內(nèi)鹽、N，N-二甲基-N-(2-^乙基）-N-(2-橫 乙基）錠內(nèi)鹽、N，N-二甲基-N-(2-徑乙基）-N-(3-橫丙基）錠鹽、N，N-二徑乙基-N-甲 基-N- (3-橫丙基）錠內(nèi)鹽、N，N-二甲基-N- (2-徑乙基）-N- (4-橫下基）錠內(nèi)鹽、N-甲 基-N-(3-橫丙基）嗎嘟內(nèi)鹽和N-甲基-N-(3-橫丙基）贓晚內(nèi)鹽。
[0061] 可W提供的甜菜堿、甜菜堿類似物和/或其他強(qiáng)化劑摩爾濃度在0.Ol和5M、0.Ol 和 4M、0.Ol和 3M、0.Ol和 2. 5M、0. 02 和 5M、0. 03 和 5M、0. 04 和 5M、0. 05 和 5M、0. 07 和 5M、 0. 1 和 5M、0. 2 和 5M、0. 3 和 5M、0. 4 和 5M、0. 5 和 5M、0. 7 和 5M、1 和 5M、1. 5 和 5M、0. 1 和 4M、0. 5 和 3M、1 和 2. 5M，或者 1. 5 和 2. 5M之間，例如大約 0. 01、0. 02、0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、 0. 75、1、1. 25、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2. 0、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、3、3. 5、4、4. 5 或 5M。替 代地，可W提供的強(qiáng)化劑w/v或v/v百分比濃度在0. 1和50 %、0. 2和50 %、0. 5和50 %、1 和 50%、2 和 50%、5 和 50%、0. 1 和 40%、0. 1 和 30%、0. 1 和 20%、0. 5 和 40%、1 和 30% 或者 2 和 20%之間，例如大約 0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50%的體 積百分比。中性去污劑可W提供體積百分比在0.OOOl和1〇%、〇. 0002和10%、0. 0005和 10%、0.OOl和 10%、0. 002 和 10%、0. 005 和 10%、0.Ol和 10%、0. 02 和 10%、0. 05 和 10%、 0.OOOl和 5%、0.OOOl和 2%、0.OOOl和 1 %、0. 0005 和 1 %，或者 0.OOl和 1 %之間，例如大 約 0. 000U0. 0002、0. 0003、0. 0004、0. 0005、0. 0006、0. 0007、0. 0008、0. 0009、0. 001、0. 002、 0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0. 04、0. 05、0. 06、0.07、 0. 08、0. 09、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 % 的體積 百分比。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確認(rèn)各種強(qiáng)化劑的適宜濃度。
[0062] 本發(fā)明設(shè)及運(yùn)樣的方法，所述方法包括給擴(kuò)增反應(yīng)提供緩沖液。所述緩沖液可W 包括例如但不限于，S徑甲基氨基甲燒燈ris)、雙S徑基甲氨基丙烷化is-trispropane)、 重碳酸鹽、憐酸鹽、甘氨酸、組氨酸、4-(2-?乙基）-1-贓嗦乙橫酸她PE巧、3-(N-嗎嘟）丙 橫酸（MOP巧和各種共輛堿/酸及其鹽。
[0063] 本發(fā)明設(shè)及運(yùn)樣的方法，所述方法包括提供至少一種DNA聚合酶由dNTPs W模板依賴性方式合成DNA。DNA聚合酶可W包括野生型、改造過的、嗜熱的、嵌 合的、工程化的和/或一種W上聚合酶的混合物。DNA聚合酶可W包括Exact Polymerase(5PRIMEGmb田、AccuSure?DNAPolymerase(Bioline)、Phusion?AccuPri me?Pfx(Invitrogen)、PlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelity(Invitrogen)、 曲ire?HotStartDNAPolymerase彷ewEnglandBiolabs)、Phusion"'HotSta;rt High-FidelityDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs)、JumpStart?REDTaq?DNA Polymerase(Sigma-Aldrich)、PfuUltra?HotstartDNAPolymerase(Stratagene)、 PfuTurboCxHotstartDNAPolymer曰se(Str曰t曰邑ene)、PrimeSTAR?HSDNA Polymerase(Takara)、ExtensorHi-FidelityPCREnzyme(ABgene)、ACCUZYME?DNA Polymerase(Bioline)、SAHARA?DNAPolymerase(Bioline)、VELOCITYDNA Polymerase(Bioline)、巧就'gCh:細(xì)從汲Ac州P0L?DNAPolymerase(GeneChoice,Inc.)、 GeneChoiceUniPOL^^^DNAPolymer曰se(GeneChoice,Inc.)、Elongase EnzymeMix(Invitrogen)、Pfx50?DNAPolymerase(Invitrogen)、PhusionDNA Polymerase(NewEnglandBiolabs)、KODHiFiDNAPolymerase(Novagen)、KOD XLDNAPolymerase(Novagen)、Expand20kbPLUSThermostableDNApolymerase mixture(RocheAppliedScience)、ExpandHighFidelityPLUSThermostableDNA polymerasemixture(民ocheAppliedScience)、ExpandHighFidelityThermostableDNA polymerasemixture(民ocheAppliedScience)、ExpandLongTemplateThermostable DNApolymerasemixture(民ocheAppliedScience)、Easy_ATMHigh-FidelityPC民Cloning Enzyme(Stratagene)、EXL?DNAPolymerase(Stratagene)、Herculasc^EnhancedDNA Polymerase(Stratagene)、HerculaseIIFusionDNAPolymerase(Stratagene)、 KapaLongRangeTMDNAPolymerase(KapaBiosystems)、KapaHiFi?DNAPolymerase(Kapa Biosystems)、Kapa2GTM民obustDNAPolymerase(KapaBiosystems)、Kapa2G?民obust HotStartDNAPolymerase(KapaBiosystems)>Kapa2G?FastDNAPolymerase(Kapa Biosystems)>Kapa2G?FastHotStartDNAPolymerase(KapaBiosystems)、LATAQ DNAPolymerase(Takara)、OptimaseDNAPolymerase(Transgenomic,Inc. )、Exo-Pfu DNAPolymerase(Stratagene)、HotMasterTaqDNAPolymerase(5PRIMEGmbH)、Ho^aq DNAPolymerase(AbnovaCorporation)、AmpliTaqGold"'DNAPolymerase(Applied Biosystems)、BstDNAPolymeraseLgFrag(NewEnglandBiolabs) >MasterAmp?TfI DNAPolymerase巧PICENT贓Biotechnologies)、RedHotDNAPolymerase(ABgene)、 ThermoprimePlusDNAPolymerase(ABgene)、Taq-redDNAPolymerase(AppliChem GmbH).BI〇-X-ACT?LongDNAPolymerase(Bioline) .BI〇-X-ACT?ShortDNA Polymerase(Bioline)、BiolineHybriPol?DNAPolymerase(Bioline)、BioThermTaqDNA Polymerase(eEnzymeLLC)、EU-TaqDNAPolymerase(eEnzymeLLC)、SynergyTaqDNA Polymerase(eEnzymeLLC)、GeneChoice、民edPOL?DNAPolymerase(GeneChoice,Inc.)、 AccuPrime?GC-RichDNAPolymerase(Invitrogen) >PyroPhage'^ 3173DNA Polymerase、ExoMinus(Lucigen)、9DegreesNorth(Modified)DNAPolymerase(New EnglandBiolabs)、TherminatorDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs)、PwoDNA Polymerase(民ocheAppliedScience)、Paq5000?DNAPolymerase(Stratagene)、 YieldAceTMDNAPolymerase(Stratagene)、e2TAK?DNAPolymerase^akara)或來自下述 的天然存在的DNA聚合酶：火球菌巧.kodakaraensis)、強(qiáng)烈火球菌（P.furiosus)、熱球 菌（T.gorgonarius、T.zilligii、T.Iitoralis"VentTM")、P.GB-D"DeepVent"、熱球 菌(T. 9N-7、T.aggrega打s、T.barossii、T.fumicola打s、T.celer)、火球菌(Pyrococcus SP.ST700株）、太平萍熱球菌（T.pacificus)、海底火球菌（P.abysii)、深棲熱球菌 (T.profundus)、T.siculi、熱水熱球菌（T.hydrothermalis)、Thermococcussp.GE8 株、 T.thioreduce打S)、火球菌(P.horikoshii)或熱球菌(T.O打打uri打eusNAUThermococcus sp. 9°N-7、Thermococcussp.GI-J、Thermococcussp.MA民-13、Thermococcussp.GB-C、 Thermococcussp.GI-H)、水生棲熱菌（Thermusaquaticus)、嗜熱棲熱菌（Thermus thermophiIes)、棲熱菌（ThermuscaldophiIus)、絲狀棲熱菌（Thermusfiliformis)、 黃棲熱菌（Thermusflavus)、海棲熱袍菌（Thermotogamaritime)、嗜熱脂肪芽抱桿菌 (Bacillusstearothermophilus)或熱堅(jiān)芽抱桿菌化acilluscaldotenax) 〇
[0064] 通過發(fā)明獲得的數(shù)據(jù)，例如測試結(jié)果，可W用于診斷是否存在某狀況或疾病的 過程。利用本發(fā)明獲得的數(shù)據(jù)可W用于確定某個(gè)體的基因型。通過發(fā)明獲得的數(shù)據(jù)可W 用于檢測與脆性X染色體綜合征、脆性X染色體相關(guān)震顫共濟(jì)失調(diào)、和脆性X染色體相關(guān) 原發(fā)性卵巢功能不全關(guān)聯(lián)的基因型。與運(yùn)些狀況相關(guān)的基因座是本領(lǐng)域已知的，包括但不 限于FMR1、FMR2、FMRl的 5'UTR、FMR2 的 5'UTR、FMRl的 5'UTR內(nèi)的CGG重復(fù)，W及FMR2 的5'UTR內(nèi)的CGG重復(fù)。在其他實(shí)施方案中，通過發(fā)明獲得的數(shù)據(jù)可W用于檢測與富含GC =核巧酸重復(fù)素亂和/或中斷元件關(guān)聯(lián)的基因型，比如脆性X染色體綜合征、脆性X染色 體相關(guān)震顫共濟(jì)失調(diào)綜合征、脆性X染色體相關(guān)原發(fā)性卵巢功能不全、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、 亨廷頓舞蹈癥、脊延髓肌萎縮、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮和/或脊髓小腦性共濟(jì)失 調(diào)。中斷元件，正如其名字暗示的，打斷一系列的重復(fù)序列。CGG富含區(qū)可能包含或不包含 中斷元件。因此，CGG富含區(qū)可W包含一系列S核巧酸重復(fù)，在運(yùn)些系列中有至少一種中斷 元件。與運(yùn)些狀況相關(guān)的基因座是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于FMR1、FMR2、DMPK、ZNF9、