Lmnb2基因及其表達產物作為鼻咽癌的診治靶標的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地涉及LMNB2基因在鼻咽癌的診斷、治療中的用 途。
【背景技術】
[0002] 鼻咽癌原發(fā)于鼻咽粘膜被覆上皮的惡性腫瘤。是我國常見的惡性腫瘤之一，惡性 變頻高，自然生存時間平均為18. 7個月。中國的廣東、廣西、福建、湖南等地為多發(fā)區(qū)，男多 于女。發(fā)病年齡大多為中年人，亦有青少年患病者。病因與種族易感性（黃種人較白種人 患病多）、遺傳因素及EB病毒感染等有關，鼻咽癌惡性程度較高，早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結 轉移。
[0003] 鼻咽癌的發(fā)病部位隱蔽，特別是在咽隱窩和鼻咽頂部者，早期癥狀不明顯，因此難 以早期發(fā)現(xiàn)，誤診誤治率較高。鼻咽癌5年生存率近年來一直徘徊在50%左右，而鼻咽癌早 期確診病人五年生存率可達90%，因此對鼻咽癌進行高危人群篩查和早期診斷，以便進行 早期治療，可顯著提高患者生存率。
[0004] 目前鼻咽癌的早期檢測方法有多種，包括EB病毒血清學標志物、鼻咽癌相關腫瘤 標記物如白細胞介素、腫瘤壞死因子、細胞間粘附因子以及端粒酶等的檢測。雖然這些指標 的單獨或聯(lián)合應用為鼻咽癌的診斷提供了有用的信息，但是它們缺乏足夠的靈敏度和特異 性。因此尋找一種靈敏度和特異性高的用于鼻咽癌早期診斷的方法是亟待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0005] 為了彌補現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于鼻咽癌早期診斷的 分子標志物。相比現(xiàn)有的鼻咽癌的診斷方法，使用基因標志物來診斷鼻咽癌的具有及時性、 特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風險，針對風險高低，采取相應的預 防和治療措施。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0007] 本發(fā)明提供了檢測LMNB2基因表達的產品在制備診斷鼻咽癌的工具中的應用。
[0008] 進一步，所述檢測LMNB2基因表達的產品包括檢測LMNB2基因mRNA水平的產品、 和/或檢測LMNB2蛋白水平的產品。
[0009] 進一步，所述檢測LMNB2基因表達的產品包括：通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢 測、原位雜交或芯片檢測LMNB2基因表達以診斷鼻咽癌的產品。
[0010] 進一步，所述用RT-PCR診斷鼻咽癌的產品至少包括一對特異擴增LMNB2基因的引 物；所述用實時定量PCR診斷鼻咽癌的產品至少包括一對特異擴增LMNB2基因的引物；所 述用免疫檢測診斷鼻咽癌的產品包括：與LMNB2蛋白特異性結合的抗體；所述用原位雜交 診斷鼻咽癌的產品包括：與LMNB2基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷鼻咽癌的 產品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與LMNB2蛋白特異性結合的抗體，基 因芯片包括與LMNB2基因的核酸序列雜交的探針。
[0011] 所述用實時定量PCR診斷鼻咽癌的產品至少包括的一對特異擴增LMNB2基因的引 物如SEQIDN0. 3 和SEQIDN0. 4 所示。
[0012] 所述檢測LMNB2基因表達的產品可以是檢測LMNB2基因表達的試劑、也可以是包 含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。
[0013] 所述診斷鼻咽癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高 通量測序平臺是一種特殊的診斷鼻咽癌的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的 基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜， 容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知LMNB2基因的異常與 鼻咽癌相關也屬于LMNB2基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種診斷鼻咽癌的工具，所述工具包括檢測LMNB2基因表達的試 劑；所述試劑包括檢測LMNB2基因mRNA的引物和/或探針、檢測LMNB2蛋白的抗體。
[0015] 所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。
[0016] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定 在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測LMNB2基因轉錄水平的針對 LMNB2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質芯片包括固相載體以及固定在固相載體的LMNB2 蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測包括LMNB2基因在內的多個基因（例如，與鼻 咽癌相關的多個基因）的表達水平。所述蛋白質芯片可用于檢測包括LMNB2蛋白在內的多 個蛋白質（例如與鼻咽癌相關的多個蛋白質）的表達水平。通過將多個與鼻咽癌的標志物 同時檢測，可大大提高鼻咽癌診斷的準確率。
[0017] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測LMNB2基因轉錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括LMNB2蛋白 的特異性抗體。進一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯 片方法檢測LMNB2基因表達水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對LMNB2基 因的引物和/或探針。根據(jù)LMNB2基因的核苷酸序列信息容易設計出可以用于檢測LMNB2 基因表達水平的引物和探針。
[0018] 所述試紙包括檢測LMNB2基因表達的試劑。
[0019] 所述高通量測序平臺包括檢測LMNB2基因表達的試劑。
[0020] 與LMNB2基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其 它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結 合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述 探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針 長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最 長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探 針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0021 ] 進一步，所述LMNB2蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述LMNB2 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與LMNB2蛋白的結合能力即可。用于蛋白質 水平的抗體的制備時本領域技術人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗 體。
[0022] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述檢測LMNB2基因mRNA的引物包括SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4所示的引物對。
[0023] 本發(fā)明還提供了LMNB2基因和/或其表達產物的抑制劑在制備治療鼻咽癌的藥物 中的應用。所述抑制劑包括抑制LMNB2基因表達的試劑、和/或抑制LMNB2基因表達產物 的試劑。
[0024] 進一步，所述抑制LMNB2基因表達的試劑包括抑制基因轉錄的試劑、抑制基因翻 譯的試劑；所述抑制LMNB2基因表達產物的試劑包括抑制LMNB2基因mRNA的試劑、抑制 LMNB2蛋白的試劑。所述抑制LMNB2基因mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制 mRNA翻譯活性的試劑。所述抑制LMNB2蛋白的試劑包括抑制LMNB2蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑 制LMNB2蛋白活性的試劑、抑制LMNB2蛋白功能的試劑。
[0025] 進一步，抑制LMNB2基因mRNA的試劑包括針對LMNB2基因mRNA的雙鏈核糖核酸； 抑制LMNB2蛋白功能的試劑包括LMNB2抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制LMNB2蛋白功能的抗體。 所述抗體可以是多克隆抗體，或是單克隆抗體。
[0026] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述針對LMNB2基因mRNA的雙鏈核糖核酸是 siRNA。為了確保LMNB2基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)LMNB2基因的mRNA序列設計 了siRNA特異性片段。siRNA的設計根據(jù)已發(fā)表的通用設計原則（Elbashiret.al2001， Schwarzet.al2003,Khvorovaet.al2003,Reynoldset.al2004,Hsiehet.al2004, Ui-Teiet.al2004)，通過在線工具完成設計，該在線工具為：siRNASelectionProgram ofWhiteheadInstitute(BingbingYuanet.al2004,http://jura.wi.mit.edu/bioc/ siRNAext/)和BLOCK-iTTMRNAiDesignerofINVITR0GEN(winnerofthe2004Frost& SullivanExcellenceinResearchAward,https://rnaidesigner.invitrogen.com/ sirna/)。為了進一步提高siRNA片斷的有效性，綜合兩個在線設計工具的優(yōu)點來設計用于 篩選的siRNA片斷。最后，通過同源性比對（NCBIBLAST)來過濾siRNA序列，以提高siRNA 片斷的特異性并減少RNAi干擾的脫靶效應。
[0027] 優(yōu)選地，所述siRNA的序列如SEQIDN0.7和SEQIDN0.8所示。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種用于治療鼻咽癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所 述的LMNB2基因和/或其表達產物的抑制劑。<