its/ml)青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基內（購自Hyclone)，取對數生長期的鼻咽 癌按1X1〇4/孔接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中細胞培養(yǎng)24h，轉染按 照脂質體轉染試劑2000 (購自于Invitrogen公司）的說明書轉染，實驗分為、陰性對照組 和實驗組（20nM)，其中，陰性對照組siRNA與LMNB2基因的序列無同源性，濃度為20nM/孔， 同時分別轉染。
[0102] 2、利用QPCR實驗檢測siRNA的干擾效率。
[0103]2. 1提取細胞總RNA利用常規(guī)方法進行操作。
[0104] 2. 2逆轉錄
[0105] 利用TAKARA公司的逆轉錄試劑盒進行RNA的逆轉錄。
[0106] 2.3QPCR
[0107] (1)引物設計
[0108] 根據Genbank中LMNB2基因和GAPDH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物，由上海 生工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下：
[0109] LMNB2 基因：
[0110] 正向引物為 5' -ATGCGTGAGAATGAGAAT-3'（SEQIDN0. 3);
[0111] 反向引物為 5' -CCTGTTGGTGGAAAAGAT-3'（SEQIDNO. 4)，
[0112] GAPDH基因：
[0113] 正向引物為 5' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQIDNO. 5);
[0114] 反向引物為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQIDNO. 6)。
[0115] ⑵按照表1配制PCR反應體系：
[0116] 其中，SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。
[0117] 表1PCR反應體系
[0120] (3)PCR反應條件：95°C10min，（95°C15s，60°C40s)*42 個循環(huán)。以SYBRGreen 作為熒光標記物，在LightCycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和 電泳確定目的條帶，△ACT法進行相對定量。
[0121] 2. 4統(tǒng)計學方法
[0122] 實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值土標準差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，干擾LMNB2基因表達組與對照組之間的差 異采用t檢驗，認為當P〈0. 05時具有統(tǒng)計學意義。
[0123] 2. 5 結果
[0124] 結果如圖 3 所示，與siRNA2-LMNB2、siRNA3-LMNB2 相比，siRNAl-LMNB2 能夠更有 效的抑制LMNB2基因的表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P〈0. 05)，使用siRNAl-LMNB2進行后續(xù) 的實驗。
[0125] 3、Westernblot實驗檢測siRNAl-LMNB2 的干擾效率
[0126] 步驟同實施例2。
[0127] 結果如圖4所示，與轉染siRNA-NC組相比，轉染siRNAl-LMNB2的細胞中LMNB2蛋 白的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P〈〇. 05)。
[0128] 實施例4LMNB2基因的表達對鼻咽癌細胞增殖能力的測定
[0129] 使用CellCounting kit-8 (cck-8)試劑盒用于檢測鼻咽癌細胞增殖
[0130] 1、步驟
[0131] 按照前面實施例的方法進行鼻咽癌細胞的培養(yǎng)和轉染，細胞分為二個實驗組：
[0132] 組1:轉染siRNA-NC細胞組；
[0133]組 2:轉染siRNA-LMNB2 細胞組。
[0134] 轉染24h后，以2. 5X105/ml密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每個實驗組設計三 復孔，每孔100μ1，放置于37°C、5 % 0)2培養(yǎng)箱中孵育，24h細胞貼壁后，分別在所需檢測的 培養(yǎng)孔內每孔加入10μ1CK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育lh，測定450nm處各孔吸光 度值（0D值）
[0135] 2、統(tǒng)計學方法
[0136] 實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值土標準差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0. 05 時具有統(tǒng)計學意義。
[0137] 3、結果
[0138] 結果如表2所示，與轉染siRNA-NC組相比，轉染siRNA-LMNB2細胞組細胞增殖緩 慢，差異具有統(tǒng)計學意義（P〈〇. 05)。上述實驗結果表明，LMNB2基因表達促進了鼻咽癌細胞 的增殖。
[0139] 表2鼻咽癌細胞0D值
[0140]
[0141] 實施例5鼻咽癌細胞抗體中和實驗
[0142] 1、步驟：
[0143] 將鼻咽癌細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2xl03個細胞/孔/200μ1，細胞貼 壁后進行如下處理：
[0144] 實驗組1(對照組）：鼻咽癌細胞中加入無關單抗（1:50);
[0145] 實驗組3:鼻咽癌細胞中加入抗人LMNB2單抗（1:50)。
[0146]將細胞在37°C、5%C02培養(yǎng)箱孵育24小時后，加入3H_TdR(lμCi/孔），再培養(yǎng)24 小時，收集細胞，加液體閃爍液，β計數儀檢測cpm值。
[0147] 2、統(tǒng)計學方法
[0148] 實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值土標準差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0. 05 時具有統(tǒng)計學意義。
[0149] 3、結果
[0150] 結果如圖5所示，相比于對照組，加入抗人LMNB2單抗的細胞組細胞增殖減緩。上 述實驗結果表明，抑制LMNB2蛋白的功能可以抑制鼻咽癌細胞增殖。
[0151] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 檢測LMNB2基因表達的產品在制備診斷鼻咽癌的工具中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述產品包括：通過RT-PCR、實時定量 PCR、免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測LMNB2基因表達以診斷鼻咽癌的產 品；所述用RT-PCR診斷鼻咽癌的產品至少包括一對特異擴增LMNB2基因的引物；所述用實 時定量PCR診斷鼻咽癌的產品至少包括一對特異擴增LMNB2基因的引物；所述用免疫檢測 診斷鼻咽癌的產品包括：與LMNB2蛋白特異性結合的抗體；所述用原位雜交診斷鼻咽癌的 產品包括：與LMNB2基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷鼻咽癌的產品包括：蛋 白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與LMNB2蛋白特異性結合的抗體，基因芯片包括與 LMNB2基因的核酸序列雜交的探針。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷鼻咽癌的產品至 少包括的一對特異擴增LMNB2基因的引物如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示。4. 一種診斷鼻咽癌的工具，其特征在于，所述工具包括檢測LMNB2基因表達的試劑；所 述試劑包括檢測LMNB2基因mRNA的引物和/或探針、檢測LMNB2蛋白的抗體。5. 根據權利要求4所述的工具，其特征在于，所述檢測LMNB2基因mRNA的引物包括SEQ IDNO. 3和SEQIDNO. 4所示的引物對。 6. LMNB2基因和/或其表達產物的抑制劑在制備治療鼻咽癌的藥物中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述抑制劑包括抑制LMNB2基因表達的試 劑、和/或抑制LMNB2基因表達產物的試劑。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述抑制LMNB2基因表達產物的試劑包括 抑制針對LMNB2基因的siRNA、和/或LMNB2蛋白的抗體。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述針對LMNB2基因的siRNA序列如SEQ IDNO. 7 和SEQIDNO. 8 所示。10. -種用于治療鼻咽癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權利要求 6-9中任一項所述的抑制劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了LMNB2基因及其表達產物可以作為鼻咽癌診治的分子標志物。通過檢測骨組織中LMNB2基因及其表達產物的含量可以判斷受試者是否患有鼻咽癌或者診斷受試者是否存在患有鼻咽癌的風險。本發(fā)明通過研究體外培養(yǎng)的鼻咽癌細胞的增殖情況發(fā)現LMNB2基因的表達抑制可以抑制鼻咽癌細胞增殖，并且通過抑制LMNB2蛋白的功能同樣可以抑制鼻咽癌細胞的增殖，上述研究結果表明LMNB2基因及其表達產物是治療鼻咽癌的一個潛在的藥物靶點。
【IPC分類】A61K45/00, A61K39/395, G01N33/68, A61K31/7088, C12Q1/68, A61P35/00, A61K48/00
【公開號】CN105296622
【申請?zhí)枴緾N201510724988
【發(fā)明人】楊承剛, 孫錦云
【申請人】北京泱深生物信息技術有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年10月29日