ymol/L-O. 4 μ mol/L用于革E1多核苷酸檢測的探針，其中，所述用于革E1多核苷 酸擴增的上下游引物的堿基序列為：上游引物：5' -TGTCTCATTTACTTTTCTGTAAGGACAT-3';下 游引物：5' -GTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTT-3'。密碼子為 240。
[0064] 所述A719G檢測反應液和A719A檢測反應液中所述用于靶多核苷酸檢測的探針的 堿基序列均為：5' FAM-AAGACAGTCAATTCCCCAACTITTATGTCGT-BHQ13'。
[0065] 以上用于靶多核苷酸擴增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測的探針是源于 TPMT基因 G238、G460、和A719位點突變所在外顯子區(qū)域的引物和探針。
[0066] 本發(fā)明設(shè)計了 G238C檢測反應液、G238G檢測反應液、G460A檢測反應液、G460G檢 測反應液、A719G檢測反應液和A719A檢測反應液6種PCR反應液，可同時檢測出TPMT*2、 TPMT*3B和TPMT*3C三種基因突變類型。同時，本TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒還增加了內(nèi) 標，利用內(nèi)標監(jiān)控PCR反應過程，監(jiān)控反應體系是否有效，防止樣本檢測假陰性。本試劑盒 操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬，應用該試劑盒，可以對臨床血液樣本中的 TPMT基因多態(tài)性進行快速檢測。
[0067] 進一步，所述G238C檢測反應液、G238G檢測反應液、G460A檢測反應液、G460G檢 測反應液、A719G檢測反應液和A719A檢測反應液內(nèi)均含有0· 2 μ mol/L-0. 4 μ mol/L的用 于內(nèi)標片段擴增的上下游引物和〇. 1 ymol/L-O. 2 ymol/L的用于檢測內(nèi)標的探針，其中， 所述上下游引物和所述探針的堿基序列分別為：上游引物：5' -TGCTTGTGAGACAAAGGTGT
[0068] CTCT-3' ；下游引物：5' -TGGTTTTTCTGTACCTCAGTATCCG-3' ；探針：5' -HEX-CTAT
[0069] GGATGGTACAAGAACTTCACTTGACATTG-BHQ1-3';所述內(nèi)標片段的堿基序列為：5' -GCA CGGAAGACATATGCTTGTGAGACAAAGGTGTCTCTGAAACTATGGATGGTACAAGAACTTCACTTGACA TTGAAGAG TACTCGGATACTGAGGTACAGAAAAACCAAGTACTAACTCTGG-3 '。
[0070] 進一步，所述G238C檢測反應液、G238G檢測反應液、G460A檢測反應液、G460G檢測 反應液、A719G檢測反應液和A719A檢測反應液內(nèi)均含有10XPCR反應緩沖液和0. 2mmol/ L脫氧核糖核苷三磷酸，其中，所述10XPCR反應緩沖液包括：pH為7. 5的200mmol/L的三 羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L的氯化鎂溶液、500mmol/L的氯化鉀溶液、體積百分 比為0. 2%的曲拉通溶液和體積百分比為10%的甲酰胺溶液；所述脫氧核糖核苷三磷酸包 括：dATP、dCTP、dGTP、dUTP 或 dTTP。
[0071] 進一步的，所述TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中 包括1U/ μ L-5U/ μ L的耐熱DNA聚合酶和0. 05U/ μ L-0. 2U/ μ L尿嘧啶DNA糖基化酶，同時 在所述PCR反應液中還包括dUTP。UNG酶具有降解含有dU的PCR產(chǎn)物的功能，利用UNG酶 和PCR反應液中的dUTP可以起到預防PCR產(chǎn)物污染的作用。
[0072] 更進一步的，所述TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒還包括TPMT陽性對照和TPMT陰 性對照，其中，TPMT陽性對照為針對G238C、G238G、G460A、G460G、A719G和A719A所在區(qū)域 合成質(zhì)粒的混合物以及包含內(nèi)標目的序列片段的質(zhì)粒，經(jīng)本公司合格的試劑盒檢測，Ct值 < 30 ;TPMT陰性對照為滅菌生理鹽水為待測樣本，經(jīng)本公司合格的試劑盒檢測為陰性后作 為陰性對照。
[0073] 實施例二
[0074] 將本TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒用于檢測人全血所提取的核酸樣本中的TPMT基 因多態(tài)性情況的操作步驟是：
[0075] -、試劑準備
[0076] 1、取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫后，混勻備用；
[0077] 2、根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，按比例（G238C檢測反應液反應液 43 μ L/人份+酶混合液2 μ L/人份；G238G檢測反應液反應液43 μ L/人份+酶混合液2 μ L/ 人份；G460A檢測反應液反應液43 μ L/人份+酶混合液2 μ L/人份；G460G突變檢測反應 液反應液43 μ L/人份+酶混合液2 μ L/人份；A719G突變檢測反應液反應液43 μ L/人份+ 酶混合液2 μ L/人份；Α719Α突變檢測反應液反應液43 μ L/人份+酶混合液2 μ L/人份） 取相應量的PCR反應液及酶混合液，充分混勻成PCR-mix，瞬時離心后備用。
[0078] 二、樣本處理
[0079] 1、使用商業(yè)化的血液基因組提取試劑盒提取DNA。
[0080] 2、根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，每個反應管加入45 μ L PCR-mix。吸 取已處理的樣本DNA、陰性對照、陽性對照各5 μ L加入PCR-mix中，蓋好管蓋。
[0081] 三、熒光定量PCR反應
[0082] 1、將PCR反應管放入擴增儀樣品槽，按對應順序設(shè)置陰性對照、陽性對照。
[0083] 2、熒光檢測通道選擇（以ABI 7500儀器為例）：
[0084] 1)選擇 FAM(Reportere:FAM, Quencher:None)檢測通道；2)內(nèi)標選擇 HEX 或 VIC 通道檢測（Reporter:VIC,Quencher:None)。參比焚光（Passive Reference)設(shè)置為 R0X〇
[0085] 3、熒光定量PCR反應條件見表1 :
[0086] 表1 :熒光定量PCR反應條件
[0088] 四、結(jié)果分析
[0089] 反應結(jié)束后，儀器自動保存結(jié)果，可以利用儀器自帶的軟件進行自動分析（也可 以手動調(diào)芐基線的開始值、結(jié)束值以及閾值線值進行分析），然后記錄樣本Ct值。擴增曲線 與閾值線的交點，稱為Ct值（即cycle threshold，指PCR反應管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的 閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)值）。
[0090] 熒光定量PCR反應結(jié)果判定如表2所示：
[0091] 表2 :熒光定量PCR反應結(jié)果

[0093] 以G238位點為例：
[0094] 圖1是本發(fā)明實施例中提供的G238位點檢測結(jié)果為野生型時G238G反應液檢測 擴增曲線圖；
[0095] 圖2是本發(fā)明實施例中提供的G238位點檢測結(jié)果為野生型時G238C反應液檢測 擴增曲線圖；
[0096] 圖3是本發(fā)明實施例中提供的G238位點檢測結(jié)果為突變型純合子時G238G反應 液檢測擴增曲線圖；
[0097] 圖4是本發(fā)明實施例中提供的G238位點檢測結(jié)果為突變型純合子時G238C反應 液檢測擴增曲線圖；
[0098] 圖5是本發(fā)明實施例中提供的G238位點檢測結(jié)果為突變型雜合子時G238G反應 液檢測擴增曲線圖；
[0099] 圖6是本發(fā)明實施例中提供的G238位點檢測結(jié)果為突變型雜合子時G238C反應 液檢測擴增曲線圖。
[0100] 本發(fā)明應用DNAStar軟件包中的SeqMan和MegAl ign軟件對Genbank中檢索到 的人TMPT基因序列，在G238、G460、A719位點，分別設(shè)計了 3套引物探針組合，各引物探針 組合包括：針對突變型特異性ARMS引物1條和針對野生型特異性ARMS引物1條，以及1條 公用下游引物、1條公用探針，經(jīng)優(yōu)化，篩選出了擴增效果最好的一套引物探針，所篩選的引 物探針組合可實現(xiàn)人TMPT基因多態(tài)性的檢測，對低至lng的DNA模板可以準確地進行基 因多態(tài)性檢測。另外，對PCR反應體系進行了優(yōu)化組合，利用