UNG酶可以降解含dU的DNA 鏈的特點(diǎn)，在PCR體系中添加了 UNG酶和dUTP，可以預(yù)防前次PCR產(chǎn)物的污染，防止樣本檢 測假陽性；在本試劑盒中還增加了內(nèi)標(biāo)，利用內(nèi)標(biāo)監(jiān)控PCR反應(yīng)過程，監(jiān)控反應(yīng)體系是否有 效，防止樣本檢測假陰性。熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過曲線形狀及Ct值判斷陰陽性，檢 測結(jié)果可作為臨床對6-巰嘌呤（6-MP)用藥劑量調(diào)整的參考，用做臨床輔助診斷。
[0101] 特異性和靈敏度試驗(yàn)表明：本試劑盒檢測企業(yè)工作參考品，陰陽性參考品符合率 為100%，靈敏度參考品的檢測結(jié)果符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0102] 精密度試驗(yàn)表明：批內(nèi)和批間重復(fù)性好，檢測結(jié)果Ct值的變異系數(shù)〈5%。
[0103] 交叉反應(yīng)試驗(yàn)表明：突變型特異性的引物探針檢測50ng野生型DNA不會出現(xiàn)非特 異擴(kuò)增，野生型特異性的引物探針檢測50ng突變型純合子DNA也不會出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。
[0104] PCR產(chǎn)物污染的預(yù)防試驗(yàn)表明：本發(fā)明的快速檢測試劑盒中加入內(nèi)標(biāo)，可以有效 監(jiān)控假陰性的存在。PCR反應(yīng)體系中加入適量的UNG酶可以預(yù)防PCR產(chǎn)物污染。
[0105] 臨床樣本的檢測試驗(yàn)表明：本試劑盒對低至lng的DNA模板可以準(zhǔn)確地進(jìn)行基因 多態(tài)性檢測。
[0106] 以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明 的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0107] 以上所述僅是本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解或?qū)崿F(xiàn)本發(fā) 明。對這些實(shí)施例的多種修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的 一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一 致的最寬的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒包 括PCR反應(yīng)液，其中，所述PCR反應(yīng)液包括G238C檢測反應(yīng)液、G238G檢測反應(yīng)液、G460A檢 測反應(yīng)液、G460G檢測反應(yīng)液、A719G檢測反應(yīng)液和Α719Α檢測反應(yīng)液，且上述6種檢測反應(yīng) 液均包括用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述G238C檢測 反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列為： 上游引物：5' -GTAAATGTATGATTTTATGCAGGTGTC-3'； 下游引物：5' -TCTGAGTAAGAAAGATTCTGCTCTGTAA-3'。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述G238G檢測 反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列為： 上游引物：5' -GTAAATGTATGATTTTATGCAGGTCTG-3'； 下游引物：5' -TCTGAGTAAGAAAGATTCTGCTCTGTAA-3'。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述G238C檢測 反應(yīng)液和G238G檢測反應(yīng)液中所述用于靶多核苷酸檢測的探針的堿基序列均為： 5' FAM-ACCGGGGACACAGTGTAGTTGGTGTG-BHQ13'。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述G460A檢測 反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列為： 上游引物：5' -TGACATGATTTGGGATAGAGCAA-3'； 下游引物：5' -CCTAITTCAAACTCATAGAAGTCTAAGC-3'。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述G460G檢測 反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列為： 上游引物：5' -TGACATGATTTGGGATAGAGCAG-3'； 下游引物：5' -CCTAITTCAAACTCATAGAAGTCTAAGC-3'。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述G460A檢測 反應(yīng)液和G460G檢測反應(yīng)液中用于靶多核苷酸檢測的探針的堿基序列均為：5' FAM-TAGTTG CCATCAATCCAGGTGATCGC-BHQ13'。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述A719G檢測 反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列為： 上游引物：5' -TGTCTCATTTACTTTTCTGTAAGGACAC-3'； 下游引物：5' -GTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTT-3'。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述A719A檢測 反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列為： 上游引物：5' -TGTCTCATTTACTTTTCTGTAAGGACAT-3'； 下游引物：5' -GTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTT-3'。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述A719G檢測 反應(yīng)液和A719A檢測反應(yīng)液中所述用于靶多核苷酸檢測的探針的堿基序列均為： 5' FAM-AAGACAGTCAATTCCCCAACTTTTATGTCGT-BHQ13'。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述G238C檢 測反應(yīng)液、G238G檢測反應(yīng)液、G460A檢測反應(yīng)液、G460G檢測反應(yīng)液、A719G檢測反應(yīng)液和 A719A檢測反應(yīng)液內(nèi)均含有用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物和用于檢測內(nèi)標(biāo)的探針，其中， 所述上下游引物和所述探針的堿基序列分別為： 上游引物：5' -TGCTTGTGAGACAAAGGTGTCTCT-3'； 下游引物：5' -TGGTTTTTCTGTACCTCAGTATCCG-3'； 探針：5' -HEX-CTATGGATGGTACAAGAACTTCACTTGACATTG-BHQ1-3'； 所述內(nèi)標(biāo)片段的堿基序列為： 5' -GCACGGAAGACATATGCTTGTGAGACAAAGGTGTCTCTGAAACTATGGATGGTACAAGAACTTCACTTGA CATTGAAGAGTACTCGGATACTGAGGTACAGAAAAACCAAGTACTAACTCTGG-3'。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述G238C檢 測反應(yīng)液、G238G檢測反應(yīng)液、G460A檢測反應(yīng)液、G460G檢測反應(yīng)液、A719G檢測反應(yīng)液 和A719A檢測反應(yīng)液內(nèi)均含有10XPCR反應(yīng)緩沖液和脫氧核糖核苷三磷酸，其中，所述 10XPCR反應(yīng)緩沖液包括：200mmol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L的氯化鎂 溶液、500mmol/L的氯化鉀溶液、體積百分比為0.2%的曲拉通溶液和體積百分比為10%的 甲酰胺溶液；所述脫氧核糖核苷三磷酸包括：dATP、dCTP、dGTP、dUTP或dTTP。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述TPMT基因 多態(tài)性檢測試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐熱DNA聚合酶和尿嘧啶DNA 糖基化酶。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述 TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒還包括TPMT陽性對照和TPMT陰性對照。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括G238C、G238G、G460A、G460G、A719G和A719A檢測反應(yīng)液，且所述6種檢測反應(yīng)液均包括10×PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物和下游引物、用于檢測靶多核苷酸的探針、用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物以及用于檢測內(nèi)標(biāo)的探針。本試劑盒操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬。應(yīng)用該試劑盒，可以對臨床血液樣本中的TPMT基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢測。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105316426
【申請?zhí)枴緾N201510890509
【發(fā)明人】戴立忠, 吳康, 黃臨迷, 高堂杰
【申請人】湖南圣維基因科技有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年12月7日