用于純化抗體的連續(xù)多步驟方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用4種緩沖溶液的三步層析方法，其用于小規(guī)模和大規(guī)模純化蛋白 質，具體而言單克隆抗體。
[0002] 發(fā)明背景
[0003]抗體純化可為生物生產中的最昂貴方面之一。通常使用三步、三樹脂層析過程 (在每一步驟中使用特定緩沖體系）來純化單克隆抗體（mAb)。該慣用純化過程涵蓋捕獲 步驟，隨后進行離子交換步驟，且以精制步驟（polishingst?。┙Y束，且通常耗費3至5個 工作日（包含儲存和開放階段（openphase))。在這些慣用過程中，這三個步驟在不同單元 操作組成的序列（sequence)中實施，其不能以連續(xù)模式操作，這是由于需要在每一步驟之 間調節(jié)pH、摩爾濃度和蛋白質濃度。這一慣用純化過程示于圖5中。因此，慣用純化過程 通常需要多種不同緩沖液以及位于每一不連續(xù)步驟之間的多種儲存單元。這些慣用純化過 程因此易于產生污染、技術故障和人為錯誤。另外，因在用于濃縮洗脫物、調節(jié)pH和電導率 及在下一步驟前儲存洗脫物的每一步驟間需要打斷，且因步驟不能在完成先前步驟之前開 始，因此這些慣用純化過程特別的長且昂貴，如在圖7中可見。
[0004] 隨著逐漸增加的細胞培養(yǎng)物滴度和更大的細胞培養(yǎng)體積被用于生產，下游處理被 視為工業(yè)瓶頸。其與單克隆抗體生產尤其相關，其中焦點已從批料體積轉移，且轉向下游處 理能力。另外，早期臨床前及臨床階段研究需要較大量可更快速產生的抗體。因此，在工業(yè) 中需要可以連續(xù)模式實施的過程/方法/工藝用于抗體純化，且用于縮短獲得批料所耗費 的時間，減小污染、技術故障及人為錯誤的風險并減小工藝規(guī)模放大的需求。
[0005] 發(fā)明簡述
[0006] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種用于純化抗體的新方法，所述方法包含呈連續(xù)模式的有限數(shù)量 的步驟，其使用減小的量的樹脂和緩沖液，同時仍允許獲得高產率的具有極佳純度水平的 純化抗體。純化的蛋白質因此適用于醫(yī)學應用。因此，所述方法可用于純化蛋白質以供臨 床試驗和/或營銷包含該蛋白質的藥物組合物。另外，這種方法無需任何步驟間調節(jié)且因 此能夠從待純化的蛋白的收獲直至最終產物都在閉合系統(tǒng)中實施。
[0007] 簡而言之，該方法以連續(xù)模式僅包含以下三個層析步驟：一個親和層析、一個多模 式樹脂或陽離子交換層析和一個陰離子交換層析（AEX)。這三個層析步驟可以任一順序實 施。此外，已發(fā)現(xiàn)在這三個層析步驟期間所使用的所有緩沖液都可從同一母液起始而制得。 有利地，這些緩沖液包含BisTris，例如與NaCl、乙酸、水和任選地NH4C1組合。因無需任 何緩沖交換，所述方法易于實施，且高度適于自動化和/或以連續(xù)模式運行。更具體地，整 個過程可僅使用4種緩沖液，確保了所有步驟之間的兼容性且允許供應鏈制造和質量控制 上的節(jié)約并減小儲存需要。
[0008]本發(fā)明的方法進一步允許減少或廢除開放階段（即打開純化系統(tǒng)以實施人工操 作（例如為新緩沖液準備層析柱、稀釋樣品或調節(jié)其pH)的步驟），由此減小污染風險并提 供了在較低等級的環(huán)境（lessclassifiedenvironment)中工作的可能性。此外，由于本 發(fā)明方法的每一層析步驟可使用可重復使用的樹脂，或令人吃驚地可重復使用丟棄式膜吸 附劑，因此可重新開始三個層析步驟組成的序列直至獲得期望的量為止，而無須人操作。具 體而言，本發(fā)明方法的所有層析步驟可使用可重復使用至少100次的樹脂或使用可重復使 用至少50次的膜吸附劑來實施。發(fā)明人事實上證實了同一丟棄式膜吸附劑可在至少50次 運行的過程中使用而并不喪失穩(wěn)定性。過程循環(huán)次數(shù)可由此縮短，使過程規(guī)模放大需求最 小化，且可減少操作和儲存消耗，這是由于可減小樹脂和緩沖液的體積且丟棄式膜吸附劑 無需在一個批次之后進行儲存。因此，本發(fā)明的方法允許快速、成本有效地產生批料并減小 純化系統(tǒng)所占據的時間，如在圖10和12中可見（與圖9和11相比）。其因此適于從工作 臺規(guī)模放大至工業(yè)規(guī)模并純化重組蛋白。
[0009] 已針對4種不同抗體來設定和實施了具體的方案。在該方案中，使在第一層析步 驟結束時獲得的粗制蛋白質洗脫液直接通過第二層析基質，具體而言通過第二層析柱或膜 吸附劑，即不經任何處理（例如pH調節(jié)、緩沖交換或稀釋），且使在第二層析步驟結束時獲 得的蛋白質洗脫物也直接通過第三層析基質，具體而言通過第三層析柱或膜吸附劑，即不 經任何處理（例如pH調節(jié)、緩沖液交換或稀釋）。該方法示于圖6中。此外，在該方案中， 將含有蛋白質的溶液以連續(xù)運行加載于第一層析基質，具體而言第一層析柱或膜吸附劑上 (參見實施例6)，在先前運行從第一層析步驟洗脫后立即開始后續(xù)運行，如在圖8所見。該 方案的優(yōu)點為：極其快速（一個序列約2小時），實現(xiàn)改進的產率（大于90%)、改進的純 度，并允許減小在使用柱時所使用的緩沖液和樹脂體積，并減少在使用膜吸附劑時所使用 的緩沖液和儲存設施。另外，這種過程具有極其靈活的優(yōu)點，這是由于所用柱的大小和/或 運行的數(shù)目可容易地適配于待純化蛋白的量。此外，其可完全自動化，以連續(xù)模式運行，且 其不包含任何開放階段。另外，其已經成功地實施于4種不同抗體而無需優(yōu)化。
[0010] 本發(fā)明由此提供從溶液純化蛋白質的方法，其包含：第一層析步驟，包含使平衡緩 沖液通過第一層析基質具體而言第一層析柱或膜吸附劑，使所述溶液通過第一層析基質具 體而言第一層析柱或膜吸附劑，使平衡緩沖液通過第一層析基質具體而言第一層析柱或膜 吸附劑，使洗滌緩沖液通過第一層析基質具體而言第一層析柱或膜吸附劑，使平衡緩沖液 通過第一層析基質具體而言第一層析柱或膜吸附劑，和使用第一洗脫緩沖液從第一層析基 質具體而言從第一層析柱或膜吸附劑洗脫粗制蛋白質洗脫液；第二層析步驟，包含使平衡 緩沖液通過第二層析基質具體而言第二層析柱或膜吸附劑，使粗制蛋白質洗脫液通過第二 層析基質具體而言第二層析柱或膜吸附劑，任選地使平衡緩沖液通過第二層析基質具體而 言第二層析柱或膜吸附劑，和使用第二洗脫緩沖液從第二層析基質具體而言從第二層析柱 或膜吸附劑洗脫蛋白質洗脫物；和第三層析步驟，包含使平衡緩沖液通過第三層析基質具 體而言第三層析柱或膜吸附劑，使蛋白質洗脫物以流過模式（intheflow-throughmode) 通過第三層析基質具體而言第三層析柱或膜吸附劑，任選地使洗滌緩沖液通過第三層析基 質具體而言第三層析柱或膜吸附劑，和從第三層析基質具體而言第三層析柱或膜吸附劑的 流過液回收純化的蛋白質。
[0011] 本發(fā)明還提供從溶液純化蛋白質的方法，其包含：第一層析步驟，包含使平衡緩 沖液通過第一層析基質具體而言第一層析柱或膜吸附劑，使一部分溶液通過第一層析基質 具體而言第一層析柱或膜吸附劑，使平衡緩沖液通過第一層析基質具體而言第一層析柱或 膜吸附劑，使洗滌緩沖液通過第一層析基質具體而言第一層析柱或膜吸附劑，使平衡緩沖 液通過第一層析基質具體而言第一層析柱或膜吸附劑，使用第一洗脫緩沖液從第一層析 基質具體而言從第一層析柱或膜吸附劑洗脫粗制蛋白質洗脫液，和任選地使衛(wèi)生緩沖液(sanitationbuffer)通過第一層析基質具體而言第一層析柱或膜吸附劑；第二層析步驟， 包含使平衡緩沖液通過第二層析基質具體而言第二層析柱或膜吸附劑，使粗制蛋白質洗脫 液通過第二層析基質具體而言第二層析柱或膜吸附劑，任選地使平衡緩沖液通過第二層析 基質具體而言第二層析柱或膜吸附劑，使用第二洗脫緩沖液從第二層析基質具體而言從第 二層析柱或膜吸附劑洗脫蛋白質洗脫物，和任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第二層析基質具體而 言第二層析柱或膜吸附劑；第三層析步驟，包含使平衡緩沖液通過第三層析基質具體而言 第三層析柱或膜吸附劑，使蛋白質洗脫物以流過模式通過第三層析基質具體而言第三層析 柱或膜吸附劑，任選地使洗滌緩沖液通過第三層析基質具體而言第三層析柱或膜吸附劑， 從第三層析基質具體而言第三層析柱或膜吸附劑的流過液回收純化的蛋白質，和任選地使 衛(wèi)生緩沖液通過第三層析基質具體而言第三層析柱或膜吸附劑；使用另一部分溶液連續(xù)重 新開始第一、第二和第三層析步驟直至使用所有溶液，并收集在每一第三層析步驟結束時 所回收的純化的蛋白質。
[0012] 在本發(fā)明的一個實施方案中，每一緩沖液都包含BisTris。在另一個實施方案 中，每一緩沖液都包含BisTris、乙酸、NaCl、水和任選地NH4C1。在本發(fā)明方法中使用Bis Tris緩沖液尤其重要，這是由于其允許避免在三個層析步驟之間調節(jié)pH且由此在閉合系 統(tǒng)中從第一步驟至最后步驟運行該方法。
[0013] 在一個實施方案中，一種層析基質是蛋白質A基質。在一個實施方案中，一種層析 基質是多模式樹脂或陽離子交換層析基質。在一個實施方案中，一種層析基質是陰離子交 換層析基質。
[0014] 在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的方法包含蛋白質A層析基質、多模式樹脂或 陽離子交換層析基質和陰離子交換層析基質，所述基質以任一順序用于三個層析步驟中。
[0015] 在本發(fā)明的一個實施方案中，第一層析基質是蛋白質A基質，第二層析基質是多 模式樹脂或陽離子交換層析基質且第三層析基質是陰離子交換層析基質。
[0016] 在本發(fā)明的一個實施方案中，每一層析基質是層析柱。在該實施方案的一個特定 的實施方案中，第一層析基質是蛋白質A柱，第二層析基質是多模式樹脂層析柱且第三層 析基質是陰離子交換層析柱。
[0017] 在本發(fā)明的另一實施方案中，每一層析基質是層析膜吸附劑。在該實施方案的一 個特定實施方案中，第一層析基質是蛋白質A膜吸附劑，第二層析基質是陽離子交換膜吸 附劑且第三層析基質是陰離子交換膜吸附劑。
[0018] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所純化蛋白質是抗體。在另一個實施方案中，抗體是 單克隆抗體。
[0019] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述方法進一步在步驟（c)后包含納米過濾步驟和 /或在納米過濾步驟后包含超濾和滲濾步驟。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述方法進一步 在步驟（c)后、在納米過濾步驟后和/或在超濾及滲濾步驟后包含低pH滅活步驟。在本發(fā) 明的一個實施方案中，該方法在步驟（a)之前包含在液體培養(yǎng)基中、優(yōu)選地在生物反應器 中進行細胞培養(yǎng)的步驟以提供含有蛋白質的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)的細胞可為哺乳動物、細菌 或酵母細胞。
[0020] 本發(fā)明因此還提供從液體培養(yǎng)基生成純化蛋白質的整合的過程。
[0021] 在本發(fā)明的某些實施方案中，第一洗脫緩沖液包含20mMBisTris和20mMNaCl， 使用乙酸調節(jié)至pH3. 7;第二洗脫緩沖液包含20mMBisTris、45mMNaCl和25mMNH4C1， 使用乙酸調節(jié)至pH7. 25或包含20mMBisTris、80mMNaCl和25mMNH4C1，使用乙酸調節(jié) 至pH6.2;平衡緩沖液包含20mMBisTris和20mMNaCl，使用乙酸調節(jié)至pH7.4;且洗滌 緩沖液包含20mMBisTris和1MNaCl，使用乙酸調節(jié)至pH7. 4。在本發(fā)明的其他實施方 案中，衛(wèi)生緩沖液包含0. 1N氫氧化鈉。
[0022] 本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含多模式樹脂或陽離子交換層析基質、蛋白質A基 質和/或陰離子交換層析基質；和至少一種包含或其組成為BisTris、乙酸、NaCl、水及任 選地NH4C1的緩沖液。在一些實施方案中，該試劑盒用于使用本發(fā)明方法從溶液純化蛋白 質。
[0023] 在一個實施方案中，該試劑盒包含多模式樹脂層析柱、蛋白質A柱和/或陰離子交 換層析柱；和至少一種包含或其組成為BisTris、乙酸、NaCl、水及任選地NH4C1的緩沖液。
[0024] 在另一個實施方案中，該試劑盒包含陽離子交換膜吸附劑、蛋白質A膜吸附劑和 /或陰離子交換膜吸附劑；和至少一種包含或其組成為BisTris、乙酸、NaCl、水及任選地 NH4C1的緩沖液。
[0025] 本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含多模式樹脂或陽離子交換層析基質、蛋白質A 基質和/或陰離子交換層析基質；和用于制備至少一種包含或其組成為BisTris、乙酸、 NaCl、水及任選地NH4C1的緩沖液的說明。在一些實施方案中，該試劑盒用于使用本發(fā)明方 法從溶液純化蛋白質。
[0026] 在一個實施方案中，該試劑盒包含多模式樹脂層析柱、蛋白質A柱和/或陰離子交 換層析柱；和用于制備至少一種包含或其組成為BisTris、乙酸、NaCl、水及任選地NH4C1的 緩沖液的說明。
[0027] 在另一個實施方案中，該試劑盒包含陽離子交換膜吸附劑、蛋白質A膜吸附劑和/ 或陰離子交換膜吸附劑；和用于制備至少一種包含或其組成為BisTris、乙酸、NaCl、水及 任選地NH4C1的緩沖液的說明。
[0028] 本發(fā)明進一步提供制備平衡緩沖液的方法，其包含產生最終濃度為20mMBis Tris和20mMNaCl的100L溶液；使用乙酸將溶液pH調節(jié)至7. 4 ;并收集25L溶液。本發(fā)明 還提供制備洗滌緩沖液的方法，其包含收集來自平衡緩沖液的制備的剩余75L溶液的25L 并向這25L溶液中添加等量的1MNaCl。本發(fā)明進一步提供制備洗脫緩沖液的方法，其包 含收集來自平衡緩沖液的制備的剩余50L溶液的25L并使用乙酸將這25L溶液的pH調節(jié) 至3. 7。本發(fā)明另外提供制備洗脫緩沖液的方法，其包含將等量（e.q.)45mMNaCl和等量 25mMNH4C1添加至來自平衡緩沖液的制備的剩余25L溶液中并使用乙酸將這25L的pH調 節(jié)至7. 25。通過本文公開的方法制得的緩沖液可用于使用本發(fā)明方法從溶液純化蛋白質。
[0029] 本文還提供通過本文所述任一方法獲得的分離蛋白質、藥物作用劑和藥物組合 物。
[0030] 從下列發(fā)明詳述并結合所附權利要求可更全面地理解公開的純化方法的這些和 其他特征及優(yōu)勢。需要注意的是權利要求的范圍由其中的記載而非由說明書中對所陳述特 征和優(yōu)點的具體討論來界定。
[0031] 在本發(fā)明的上下文中，除非另外指明，否則術語"包含"、"具有"、"包含"和"含有" 應解釋為開放性術語（即指"包括但不限于")。另外，術語"包含"涵蓋"由......組成"（舉 例而言，"包含"x的組合物可排他性地由X組成或可包含其他物質（例如X+Y))。
[0032] 附圖簡述
[0033] 在結合下列圖閱讀時，可最佳地理解公開的純化方法的實施方案的下列詳細描 述。
[0034] 圖1展示用于配制實施例2至7中公開的純化方法的緩沖液的方案示意圖。
[0035] 圖2展示代表用于三種NH4C1濃度的第二洗脫緩沖液的甜蜜點（sweetspots)的 圖形。
[0036] 圖3展示代表實施例5中15個運行中的每一個中HMW、產率、HCP和DNA的趨勢分 析圖。
[0037] 圖4展示代表實施例8中50個運行中的每一個中HMW、LMW、HCP和DNA的趨勢分 析圖。
[0038] 圖5展示用于純化蛋白質的慣用過程的不同步驟示意圖。BH:批量收獲；EqB#l:第 一平衡緩沖液；WB#1 :第一洗滌緩沖液；E1B#1 :第一洗脫緩沖液；EqB#2 :第二平衡緩沖液； WB#2 :第二洗滌緩沖液；E1B#2 :第二洗脫緩沖液；EqB#3 :第三平衡緩沖液；WB#3 :第三洗滌 緩沖液；層析1 :第一層析步驟；層析2 :第二層析步驟；層析3 :第三層析步驟；pHadjust.: pH調節(jié)；cone,adjust.:濃度調節(jié)；conduct,adjust.:電導率調節(jié)；samp.:米樣；stor.:儲 存；filt.:過濾；Nanofilt.:納米過濾；TFF:切向流過濾。
[0039] 圖6展示本發(fā)明方法的不同步驟的示意圖。BH:批量收獲；EqB#l:第一平衡緩 沖液；WB#1 :第一洗滌緩沖液；E1B#1 :第一洗脫緩沖液；E1B#2 :第二洗脫緩沖液；層析1 : 第一層析步驟；層析2 :第二層析步驟；層析3 :第三層析步驟；samp.:采樣；stor.:儲存； Nanof.:納米過濾；TFF:切向流過濾。
[0040] 圖7展示包含數(shù)次運行或循環(huán)的用于純化蛋白質的慣用過程的不同步驟示意圖。 Clar.:澄清；EqB#l:第一平衡緩沖液；WB#1 :第一洗滌緩沖液；E1B#1 :第一洗脫緩沖液； EqB#2 :第二平衡緩沖液；WB#2 :第二洗滌緩沖液；E1B#2 :第二洗脫緩沖液；EqB#3 :第三平 衡緩沖液;WB#3 :第三洗滌緩沖液；層析1 :第一層析步驟；層析2 :第二層析步驟；層析3 : 第三層析步驟；Nanof.:納米過濾；UF/DF:超濾/滲濾。
[0041] 圖8展示包含數(shù)次運行或循環(huán)的本發(fā)明方法的不同步驟示意圖。Clar.:澄清； EqB#l:第一平衡緩沖液；WB#1 :第一洗滌緩沖液；E1B#1 :第一洗脫緩沖液；E1B#2 :第二洗 脫緩沖液；層析1 :第一層析步驟；層析2 :第二層析步驟；層析3 :第三層析步驟；Nanof.: 納米過濾；UF/DF:超濾/滲濾。
[0042] 圖9展示包含數(shù)次運行或循環(huán)的純化蛋白質的慣用過程中不同步驟的時間線示 意圖。表中的第一行展示時間（小時）。Clar.:澄清；層析1 :第一層析步驟；層析2 :第二 層析步驟；層析3 :第三層析步驟；低pHinact.:低pH滅活；Nanof.:納米過濾；UF/DF:超 濾/滲濾。圓代表過程完成時的時間。
[0043] 圖10展示包含數(shù)次運行或循環(huán)的本發(fā)明方法的不同步驟時間線的示意圖。 Clar.:澄清；層析1 :第一層析步驟；層析2 :第二層析步驟；層析3 :第三層析步驟； Nanof.:納米過濾；UF/DF:超濾/滲濾。圓代表過程完成時的時間。