構單元通常包含四聚體。每一這樣的四聚體通常由多肽鏈的兩 個相同對構成，每一對具有一個全長輕鏈（通常具有約25kDa的分子量）和一個全長重鏈 (通常具有約50-70kDa的分子量）。每一輕鏈和重鏈的氨基末端部分通常包括通常負責抗 原識別的約100至110或更多個氨基酸的可變區(qū)。每一鏈的羧基末端部分通常界定負責效 應器功能的恒定區(qū)。人輕鏈通常分類為K及λ輕鏈。重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或 ε，且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有數(shù)種亞類，包括但不 限于IgGl、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有亞類，包括但不限于IgMl及IgM2。類似地，IgA也 相似地分為亞類，包括但不限于IgAl及IgA2。在全長輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通常 由約12個或更多個氨基酸的"J"區(qū)連結(jié)，其中重鏈還包括約10個或更多個氨基酸的"D" 區(qū)。
[0179] 每一輕鏈/重鏈對的可變區(qū)通常形成抗原結(jié)合位點?？勺儏^(qū)通常展現(xiàn)由三個超變 區(qū)（也稱為互補決定區(qū)或CDR)連結(jié)的相對保守框架區(qū)（FR)的相同通用結(jié)構。來自每一對 的兩條鏈的CDR通常通過框架區(qū)對準，這使得能夠結(jié)合至特定表位。輕鏈和重鏈可變區(qū)二 者從N末端至C末端通常包含結(jié)構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常根據(jù)以 下文獻的定義來將氨基酸分配至每一結(jié)構域：Kabat等，1991，SequencesofProteinsof ImmunologicalInterest，第 5 版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH PublicationNo. 91-3242。雙特異性或雙功能抗體通常是具有兩個不同重鏈/輕鏈對和兩 個不同結(jié)合位點的人工雜合抗體。
[0180]F(ab)片段包含一個輕鏈和一個重鏈的CH1和可變區(qū)。F(ab)分子的重鏈不能與 另一重鏈分子形成二硫鍵。F(ab')片段含有一條輕鏈和一條在CH1和CH2結(jié)構域間含有 多個恒定區(qū)的重鏈，從而可在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab' )2分子。Fv區(qū)包 含來自重鏈和輕鏈二者的可變區(qū)，但無恒定區(qū)。單鏈抗體是Fv分子，其中重鏈和輕鏈可變 區(qū)由柔性接頭連接以形成單一多肽鏈，該單一多肽鏈形成抗原結(jié)合區(qū)。在某些實施方案中， 除"多特異性"或"多功能"抗體外的雙價抗體應理解為包含具有相同抗原特異性的結(jié)合位 點。
[0181] 可通過所公開的方法純化的單克隆抗體（mAb)可通過各種技術產(chǎn)生，包括慣用單 克隆抗體方法，例如本領域熟知的標準體細胞雜交技術。盡管體細胞雜交程序是優(yōu)選，但原 則上可采用其他用于產(chǎn)生單克隆抗體的技術，例如B淋巴細胞的病毒或致癌性轉(zhuǎn)化。單克 隆抗體可對應例如鼠類、嵌合、人源化或全人抗體。
[0182] 在一個具體的實施方案中，通過本發(fā)明方法純化的抗體選自下組的單克隆抗體： 特異性結(jié)合至人β-淀粉樣蛋白的原纖維體形式的抗體（例如人源化抗體）、特異性結(jié)合至 細菌表面多糖聚-Ν-乙?；咸前罚≒NAG)的抗體（例如全人抗體）、特異性結(jié)合至癌胚抗 原相關細胞粘附分子5 (CEACAM5)的抗體和特異性結(jié)合至CD38跨膜糖蛋白的抗體（例如人 源化抗體）。
[0183] 可通過本發(fā)明方法純化的抗體的非限制性實例還包含：帕尼單抗 (panitumumab)、奧馬珠單抗（omalizumab)、阿巴伏單抗（abagovomab)、阿昔單 抗（abciximab)、阿克蘇單抗（actoxumab)、阿達木單抗（adalimumab)、阿德木單 抗（adecatumumab)、阿非莫單抗（afelimomab)、阿夫土 珠單抗（afutuzumab)、阿拉 珠單抗（alacizumab)、阿侖珠單抗（alemtuzumab)、阿里羅單抗（alirocumab)、阿妥 莫單抗（altumomab)、阿瑪西單抗（amatuximab)、阿納莫單抗（anatumomab)、阿普 珠單抗（apolizumab)、阿替奴單抗（atinumab)、托珠單抗（tocilizumab)、巴息紫 單抗（basilizimab)、貝妥莫單抗（bectumomab)、貝利木單抗（belimumab)、貝伐單 抗（bevacizumab)、比西單抗（biciromab)、卡那單抗（canakinumab)、西妥昔單抗 (cetuximab)、達珠單抗（daclizumab)、登蘇單抗（densumab)、艾庫珠單抗（eculizumab)、 依決洛單抗（edrecolomab)、依法珠單抗（efalizumab)、依芬古單抗（efungumab)、厄妥 索單抗（ertumaxomab)、埃達珠單抗（etaracizumab)、依那西普（etanercept)、戈利木 單抗（golimumab)、英夫利昔單抗（infliximab)、那他珠單抗（natalizumab)、帕利珠單 抗（palivizumab)、帕尼單抗、帕妥珠單抗（pertuzumab)、蘭尼單抗（ranibizumab)、利妥 昔單抗（rituximab)、托珠單抗（tocilizumab)、曲妥珠單抗（trastuzumab)、杜匹魯單抗 (dupilumab)、撒里路單抗（sarilumab)或夫蘇木單抗（fresolimumab)。
[0184] 在某些方面中，待純化蛋白是酶。
[0185] 可通過本發(fā)明方法純化的酶的非限制性實例包括酸性α-葡糖苷酶、a-L-艾杜 糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙酰肝素Ν-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性β-半 乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、Ν-乙?；咸前?1-磷酸轉(zhuǎn)移酶、α-Ν-乙?；肴樘前?酶（α-半乳糖苷酶Β)、酸性脂肪酶、溶酶體酸性神經(jīng)酰胺酶、酸性鞘磷酯酶、β-葡糖苷酶、 半乳糖神經(jīng)酰胺酶、α-半乳糖苷酶Α、酸性β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神經(jīng)胺酸酶、 己糖胺酶Α或己糖胺酶Β。
[0186] 可通過本發(fā)明方法純化的蛋白質(zhì)的其他非限制性實例包括人紅細胞生成素、腫瘤 壞死因子（例如TNF-α、TNF-β或TNF-K)、干擾素α或干擾素β。
[0187] 含有待純化蛋白的溶液可為培養(yǎng)基，優(yōu)選為澄清的培養(yǎng)基。含有待純化蛋白的溶 液是例如在灌注生物反應器或補料分批生物反應器中獲得的培養(yǎng)基。
[0188] 灌注生物反應器或補料分批生物反應器的實例公開于美國臨時專利申請案第 61/775, 060號（其全部內(nèi)容以提述方式并入本文）中。
[0189] 術語"澄清的培養(yǎng)基"意指基本上不含（例如至少80%、85%、90%、92%、94%、 96%、98%或99%不含）哺乳動物、細菌或酵母細胞的從哺乳動物、細菌或酵母細胞培養(yǎng)物 獲得的液體培養(yǎng)基。
[0190] 本文所用的短語"回收蛋白質(zhì)"指在使用公開的純化方法之后收集蛋白質(zhì)?？墒?用各種標準蛋白質(zhì)層析技術來實現(xiàn)所公開的純化方法，所述層析技術例如但不限于親和層 析、離子交換層析、疏水性相互作用層析、凝膠過濾層析和多模式樹脂層析。
[0191] 在所公開的方法的某些實施方案中，第一層析基質(zhì)是蛋白質(zhì)Α基質(zhì)。在所公開的 方法的特定實施方案中，第一層析基質(zhì)是蛋白質(zhì)A柱。在所公開的方法的其他特定實施方 案中，第一層析基質(zhì)是蛋白質(zhì)A膜吸附劑。蛋白質(zhì)A基質(zhì)、具體而言蛋白質(zhì)A柱或蛋白質(zhì)A 膜吸附劑經(jīng)由樹脂配體與蛋白質(zhì)間的親和力發(fā)揮作用，從而允許高效去除雜質(zhì)。在所公開 的方法中使用蛋白質(zhì)A基質(zhì)、具體而言使用蛋白質(zhì)A柱或蛋白質(zhì)A膜吸附劑的另一優(yōu)點在 于mAb針對蛋白質(zhì)A具有通用親和力。在所公開的方法的一個實施方案中，蛋白質(zhì)A柱是 MabSelectSure樹脂（GEHealthcare)。在所公開的方法的另一實施方案中，蛋白質(zhì)A柱 是AbsoluteHighCap(Novasep)。在所公開的方法的一個實施方案中，蛋白質(zhì)A膜吸附劑 是Sartobind蛋白質(zhì)A膜吸附劑（Sartorius)。
[0192] 在所公開的方法的其他實施方案中，第二層析基質(zhì)是多模式（混合模式）樹脂或 陽離子交換層析基質(zhì)。在所公開的方法的特定實施方案中，第二層析基質(zhì)是多模式（混合 模式）樹脂層析柱。多模式樹脂與感興趣蛋白質(zhì)經(jīng)由若干使用mAb:離子、疏水性及氫鍵相 互作用的機制來發(fā)生相互作用。更具體而言，在多模式樹脂層析柱中，mAb:離子相互作用是 mAb:陽離子相互作用，與發(fā)生于經(jīng)典陰離子交換層析（AEX)柱中的mAb:陰離子相互作用相 反。
[0193] 在所公開的方法的一個具體實施方案中，多模式樹脂是CaptoMMC樹脂（GE Healthcare)。CaptoMMC是具有高度交聯(lián)瓊脂糖基底基質(zhì)的多模式陽離子交換劑。 CaptoMMC的特性匯總于下文中（參見GEHealthcareLifeSciences，數(shù)據(jù)文件： 11-0035-45AA)〇
[0194]
[0195] 在所公開的方法的其他特定實施方案中，第二層析基質(zhì)是陽離子交換膜吸附劑。
[0196] 在所公開的方法的一個其他具體實施方案中，陽離子交換膜吸附劑是Sartobind S膜吸附劑（Sartorius)。在所公開的方法的另一具體實施方案中，陽離子交換膜吸附劑是 NatriPurHD-C膜吸附劑（Natrix)。
[0197] 在所公開的方法的其他實施方案中，第三層析基質(zhì)是陰離子交換層析基質(zhì)。在所 公開的方法的特定實施方案中，第三層析基質(zhì)是陰離子交換層析柱。在所公開的方法的其 他特定實施方案中，第三層析基質(zhì)是陰離子交換膜吸附劑。共價交聯(lián)至陰離子交換基質(zhì)、具 體而言陰離子交換樹脂的惰性聚合支持物的帶正電荷的有機部分與感興趣的蛋白質(zhì)經(jīng)由mAb:陰離子相互作用來發(fā)生相互作用。在所公開的方法的一個實施方案中，陰離子交換層 析柱是BioProQ75(YMC)。BioProQ75的特性匯總于下文中（參見YMC-BioProQ75及S75 數(shù)據(jù)表）。
[0198]
[0199] 在所公開的方法的另一實施方案中，陰離子交換膜吸附劑是SartobindQ膜吸附 劑（Sartorius)。在所公開的方法的另一實施方案中，陰離子交換膜吸附劑是Sartobind STIC膜吸附劑（Sartorius)。在所公開的方法的另一實施方案中，陰離子交換膜吸附劑是 HD-Q膜吸附劑（Natrix)。
[0200] 在一個實施方案中，本發(fā)明方法并不包括在第一層析步驟結(jié)束時和/或在第二層 析步驟結(jié)束時調(diào)節(jié)粗制蛋白質(zhì)洗脫液和/或蛋白質(zhì)洗脫物的pH。
[0201] 在一個特定的實施方案中，使在第一層析步驟結(jié)束時所獲得的粗制蛋白質(zhì)洗脫液 直接通過第二層析基質(zhì)、具體而言第二層析柱或膜吸附劑。更具體而言，然后并不在兩個步 驟之間實施處理（例如pH調(diào)節(jié)、緩沖液交換或稀釋）。在該方法中，多模式樹脂層析柱可例 如對應于CaptoMMC柱。在這樣的方法中，陽離子交換膜吸附劑可例如對應于Sartobind S膜吸附劑。另外，在一個特定的實施方案中，使在第二層析步驟結(jié)束時所獲得的蛋白質(zhì)洗 脫物直接通過第三層析基質(zhì)、具體而言第三層析柱或膜吸附劑。更具體而言，然后在兩個步 驟之間不實施處理（例如pH調(diào)節(jié)、緩沖液交換或稀釋）。在這樣的方法中，多模式樹脂層析 柱可例如對應于CaptoMMC柱和/或陰離子交換層析柱可例如對應于BioProQ75柱。此 方法的具體實例公開于實施例4中。在這樣的方法中，陽離子交換膜吸附劑可例如對應于 SartobindS膜吸附劑和/或陰離子交換層析膜吸附劑可例如對應于SartobindQ膜吸附 劑。該方法的具體實例公開于實施例8中。
[0202] 在這樣的方法中，完全不存在需要人工干預并打開純化系統(tǒng)的步驟間處理（例如 在滅活容器中稀釋、后失活過濾（postinactivityfiltration)和在蛋白質(zhì)A匯集容器中 調(diào)節(jié)pH)。
[0203] 本發(fā)明方法中使用的層析基質(zhì)可為較小的生物負荷層析基質(zhì)（例如γ輻照的層 析基質(zhì)）。較小的生物負荷層析基質(zhì)的實例公開于美國臨時專利申請案61/928, 906中，其 全部內(nèi)容以提述并入本文。
[0204] 本發(fā)明方法可由此在包括第一、第二和第三層析基質(zhì)的MCCS中實施。
[0205] 術語"多柱層析系統(tǒng)"或"MCCS"指總共具有兩個或更多個互連或切換的層析柱和 /或?qū)游瞿さ南到y(tǒng)。多柱層析系統(tǒng)的非限制性實例是含有總共兩個或更多個互連或切換的 層析柱和/或?qū)游瞿さ闹芷谛阅媪鲗游鱿到y(tǒng)（PCCS)。多柱層析系統(tǒng)的其他實施例公開于本 文中且為本領域已知。
[0206] 存在于MCCS中的層析柱和/或?qū)游瞿た赏ㄟ^切換機制（例如柱切換機制）彼此連 接或移動。MCCS還可包括一個或多個（例如兩個、三個、四個或五個）栗（例如自動化栗， 例如自動化蠕動栗）。可通過檢測待純化蛋白的水平（通過對應于通過MCCS的流體（例 如MCCS中一個或多個層析柱和/或?qū)游瞿さ妮斎胛锖?或洗脫物）中的特定蛋白質(zhì)的水 平的UV吸光度來檢測）、液體（例如緩沖液）的特定體積或已經(jīng)過的特定時間來觸發(fā)柱切 換事件。柱切換通常指如下機制：使MCCS中的至少兩個不同層析柱和/或?qū)游瞿ぃɡ绱?在于MCCS中的兩個或更多個不同層析柱和/或?qū)游瞿ぃ┰谥辽龠^程中的一部分時間期間 在實質(zhì)上相同時間通過不同步驟（例如平衡、裝載、洗脫或洗滌）。
[0207] 存在于MCCS中的層析柱和/或?qū)游瞿た删哂斜疚乃枋龅娜我焕拘孕螤?、?小、體積（床體積）和/或單元操作中的一種或多種。
[0208] 存在于MCCS中的層析柱和/或?qū)游瞿た珊斜疚乃龌虮绢I域已知任一例示性 樹脂中的一種或多種。舉例而言，包含于一種或多種存在于MCCS中的層析柱和/或?qū)游瞿?中的樹脂可為利用捕獲機制（例如蛋白質(zhì)A結(jié)合捕獲機制、蛋白質(zhì)G結(jié)合捕獲機制、抗體或 抗體片段結(jié)合捕獲機制、基質(zhì)結(jié)合捕獲機制、輔因子結(jié)合捕獲機制、適配體結(jié)合捕獲機制和 /或標簽結(jié)合捕獲機制）的樹脂。包含于MCCS的一種或多種層析柱和/或?qū)游瞿ぶ械臉渲?可為陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、分子篩樹脂或疏水性相互作用樹脂或其任何組合。 本領域已知可用于純化蛋白質(zhì)的樹脂的其他實例且可包含于存在于MCCS中的一種或多種 層析柱和/或?qū)游瞿ぶ?。存在于MCCS中的層析柱和/或?qū)游瞿た珊邢嗤?或不同的 樹脂（例如本文所闡述或本領域已知用于重組蛋白純化的任何樹脂）。
[0209] 存在于MCCS中的層析柱和/或?qū)游鰳渲蓪嵤┮粋€或多個單元操作（例如捕獲 蛋白質(zhì)、純化蛋白質(zhì)、精制蛋白質(zhì)、滅活病毒、調(diào)節(jié)含有蛋白質(zhì)的流體的尚子濃度和/或pH 或過濾含有蛋白質(zhì)的流體）。在非限制性實例中，MCCS可實施從流體（例如液體培養(yǎng)基） 捕獲蛋白質(zhì)和使存在于含有重組治療性蛋白的流體中的病毒滅活的單元操作。MCCS可實施 本文所闡述或本領域已知的兩個或更多個單元操作的任何組合。
[0210] MCCS可配備下列：一個或多個（例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九 個或十個）UV監(jiān)測器、一個或多個（例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十 個）閥門、一個或多個（例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、Λ個、九個或十個）pH計 和/或一個或多個（例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個）電導率計。 MCCS還可配備利用軟件（例如基于Unicom的軟件，GEHealthcare，Piscataway，NJ)的操 作系統(tǒng)，所述軟件用于在應該發(fā)生柱切換時進行感應（例如基于UV吸光度、液體體積或逝 去時間）及實現(xiàn)（觸發(fā)）柱切換事件。在MCCS包括一個或多個UV檢測器的實例中，可任選 地將UV檢測器置于MCCS中的一個或多個（例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個或十個）層析柱和/或?qū)游瞿さ娜肟谔幒?或MCCS中的一個或多個層析柱和/或?qū)?析膜的出口處。
[0211] MCCS可進一步包括一個或多個（例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個、i^一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十 個、二i^一個、二十二個、二十三個或二十四個）在線緩沖液調(diào)節(jié)儲存器和/或緩沖液儲存 器。在其他實例中，MCCS可包括一個或多個（例如二個、三個、四個、五個或六個）斷流箱 (breaktank)，其可容納無法容易地進入MCCS中的一個或多個層析柱和/或?qū)游瞿さ牧?體。本文所述的系統(tǒng)可含有一個或多個斷流箱。本文所述系統(tǒng)的其他實例并不包括斷流箱。
[0212] MCCS可包括入口，流體（例如實質(zhì)上不含細胞的液體培養(yǎng)基）可穿過該入口進入 所述MCCS中。入口可具有本領域已知用于這些目的的任何結(jié)構。其可包括例如允許插入 流體導管的螺紋（threading)、肋材（ribbing)或密封件，從而在將流體導管插入至入口中 之后，流體會經(jīng)由入口進入MCCS且流體并不從入口顯著滲出?？捎糜诒鞠到y(tǒng)中的非限制性 入口為那些本領域的技術人員已知且會理解的。本文所提供系統(tǒng)的一些實例還包括與MCCS 入口流體連接的生物反應器。本文所述或本領域已知的任一示例性生物反應器可用于本發(fā) 明系統(tǒng)中。
[0213] MCCS可包括出口，蛋白質(zhì)可穿過該出口離開系統(tǒng)。出口可包括例如容許插入流體 導管的螺紋、肋材或密封件或經(jīng)設計以含有或儲存蛋白質(zhì)的小瓶。出口可含有能用于將無 菌小瓶或其他此類儲存容器密封于出口之上的表面以使蛋白質(zhì)直接流入無菌小瓶或儲存 容器中?？捎糜诒景l(fā)明系統(tǒng)中的非限制性出口為那些本領域的技術人員已知并會理解的。
[0214] 本文所提供系統(tǒng)的一些實例還包括栗系統(tǒng)。栗系統(tǒng)可包括一個或多個下列部分： 一個或多個（例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個）栗（例如本文所 闡述或本領域已知