[0044] 圖11展示包含數(shù)次運行或循環(huán)的純化蛋白質(zhì)的慣用過程中不同步驟的時間線示 意圖。表中的第一行展示時間（小時）。Clar.:澄清；層析1 :第一層析步驟；層析2 :第二 層析步驟；層析3 :第三層析步驟；低pHinact.:低pH滅活；Nanof.:納米過濾；UF/DF:超 濾/滲濾。示出了過程的生產(chǎn)力的估計值。
[0045] 圖12展示包含數(shù)次運行或循環(huán)的本發(fā)明方法的不同步驟時間線的示意圖。 Clar.:澄清；層析1 :第一層析步驟；層析2 :第二層析步驟；層析3 :第三層析步驟； Nanof.:納米過濾；UF/DF:超濾/滲濾。示出了過程的生產(chǎn)力的估計值。
[0046] 發(fā)明詳述
[0047] 基于混合模式樹脂（也稱為多模式樹脂）和層析膜吸附劑的可用性，發(fā)明人已研 發(fā)了僅使用三個層析步驟的新純化過程。換而言之，該方法僅包含三個涉及通過層析基質(zhì) 的步驟。
[0048] 本發(fā)明是關(guān)于從溶液純化蛋白質(zhì)的方法，其包含以下步驟或由其組成：
[0049] (a)第一層析步驟，包含：
[0050]-使該溶液通過第一層析基質(zhì)；
[0051] -使用第一洗脫緩沖液從第一層析基質(zhì)洗脫粗制蛋白質(zhì)洗脫液；
[0052] (b)第二層析步驟，包含：
[0053]-使在步驟（a)結(jié)束時所獲得的粗制蛋白質(zhì)洗脫液通過第二層析基質(zhì)；
[0054]-使用第二洗脫緩沖液從第二層析基質(zhì)洗脫蛋白質(zhì)洗脫物；和
[0055] (c)第三層析步驟，包含：
[0056] -使在步驟（b)結(jié)束時所獲得的蛋白質(zhì)洗脫物以流過模式通過第三層析基質(zhì)；
[0057]-從第三層析基質(zhì)的流過液回收純化蛋白質(zhì)；
[0058] 其中所述緩沖液中的每一種都包含BisTris。
[0059] 更具體而言，上述兩個第一層析步驟中的每一個可包含以下步驟或由其組成：
[0060] -使平衡緩沖液通過層析基質(zhì)；
[0061] -使溶液或粗制蛋白質(zhì)洗脫液通過層析基質(zhì)（如上所述）；
[0062] -使平衡緩沖液通過層析基質(zhì)；
[0063] -任選地使洗滌緩沖液通過層析基質(zhì)；
[0064] -任選地使平衡緩沖液通過層析基質(zhì)；
[0065] -使用洗脫緩沖液從層析基質(zhì)洗脫粗制蛋白質(zhì)洗脫液或蛋白質(zhì)洗脫物（如上所 述），
[0066] 其中所述緩沖液中的每一種都包含BisTris。
[0067] 本發(fā)明還關(guān)于從溶液純化蛋白質(zhì)的方法，其包含以下步驟或由其組成：
[0068] (a)第一層析步驟，包含：
[0069] -使一部分所述溶液通過第一層析基質(zhì)；
[0070] -使用第一洗脫緩沖液從第一層析基質(zhì)洗脫粗制蛋白質(zhì)洗脫液；和 [0071 ]-任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第一層析基質(zhì)；
[0072] (b)第二層析步驟，包含：
[0073]-使在步驟（a)結(jié)束時所獲得的粗制蛋白質(zhì)洗脫液通過第二層析基質(zhì)，
[0074]-使用第二洗脫緩沖液從第二層析基質(zhì)洗脫蛋白質(zhì)洗脫物，和
[0075]-任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第二層析基質(zhì)；
[0076] (c)第三層析步驟，包含：
[0077] -使在步驟（b)結(jié)束時所獲得的蛋白質(zhì)洗脫物以流過模式通過第三層析基質(zhì)，
[0078]-從第三層析基質(zhì)的流過液回收純化蛋白質(zhì)，和
[0079]-任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第三層析基質(zhì)；
[0080] 使用另一部分溶液連續(xù)重新開始步驟（a)、（b)和（c)直至使用所有溶液，并
[0081] 收集每一步驟（c)結(jié)束時所回收的純化蛋白質(zhì)；
[0082] 其中平衡緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液中的每一種都包含BisTris。
[0083] 在本發(fā)明的上下文中，表達"層析基質(zhì)"是指任種類的顆粒吸收劑介質(zhì)、樹脂或其 他固相（例如膜），其在純化過程中用作吸收劑來分離待純化分子和存在于混合物中的其 他分子?；|(zhì)，具體而言由樹脂組成的基質(zhì)可呈柱的形式，或呈膜吸附劑形式。
[0084] 在本發(fā)明的上下文中，"膜吸附劑"指具有離子基團且包含附著的功能基團（例如 親和基團和離子交換基團）的丙烯酸聚合物的平片。樹脂和膜之間的差異之一是流動分 布：樹脂通過擴散而膜通過對流。
[0085] 在本發(fā)明方法的一個實施方案中，第一、第二和第三層析基質(zhì)是層析柱。在本發(fā)明 方法的另一實施方案中，第一、第二和第三層析基質(zhì)是層析膜吸附劑。
[0086] 因此，在一個實施方案中，本發(fā)明關(guān)于從溶液純化蛋白質(zhì)的方法，其包含以下步驟 或由其組成：
[0087] (a)第一層析步驟，包含：
[0088] -使該溶液通過第一層析柱；
[0089] -使用第一洗脫緩沖液從第一層析柱洗脫粗制蛋白質(zhì)洗脫液；
[0090] (b)第二層析步驟，包含：
[0091] -使在步驟（a)結(jié)束時所獲得的粗制蛋白質(zhì)洗脫液通過第二層析柱；
[0092] -使用第二洗脫緩沖液從第二層析柱洗脫蛋白質(zhì)洗脫物；和
[0093] (c)第三層析步驟，包含：
[0094] -使在步驟（b)結(jié)束時所獲得的蛋白質(zhì)洗脫物以流過模式通過第三層析柱；
[0095] -從第三層析柱的流過液回收純化蛋白質(zhì)；
[0096] 其中所述緩沖液中的每一種都包含BisTris。
[0097] 更具體而言，上述兩個第一層析步驟中的每一種可包含以下步驟或由其組成：
[0098] -使平衡緩沖液通過層析柱；
[0099] -使溶液或粗制蛋白質(zhì)洗脫液通過層析柱（如上所述）；
[0100] -使平衡緩沖液通過層析柱；
[0101] -任選地使洗滌緩沖液通過層析柱；
[0102] -任選地使平衡緩沖液通過層析柱；
[0103] -使用洗脫緩沖液從層析柱洗脫粗制蛋白質(zhì)洗脫液或蛋白質(zhì)洗脫物（如上所述），
[0104] 其中所述緩沖液中的每一種都包含BisTris。
[0105] 本發(fā)明還關(guān)于從溶液純化蛋白質(zhì)的方法，其包含以下步驟或由其組成：
[0106] (a)第一層析步驟，包含：
[0107]-使一部分該溶液通過第一層析柱；
[0108] -使用第一洗脫緩沖液從第一層析柱洗脫粗制蛋白質(zhì)洗脫液，和
[0109] -任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第一層析柱；
[0110] (b)第二層析步驟，包含：
[0111] -使在步驟（a)結(jié)束時所獲得的粗制蛋白質(zhì)洗脫液通過第二層析柱，
[0112] -使用第二洗脫緩沖液從第二層析柱洗脫的蛋白質(zhì)洗脫物，和
[0113] -任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第二層析柱；
[0114] (c)第三層析步驟，包含：
[0115] -使在步驟（b)結(jié)束時所獲得的蛋白質(zhì)洗脫物以流過模式通過第三層析柱，
[0116] -從第三層析柱的流過液回收純化的蛋白質(zhì)，和
[0117] -任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第三層析柱；
[0118] 使用另一部分溶液連續(xù)重新開始步驟（a)、（b)和（c)直至使用所有溶液，及
[0119] 收集在每一步驟（c)結(jié)束時所回收的純化的蛋白質(zhì)；
[0120] 其中所述平衡緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液中的每一種都包含BisTris。
[0121] 在另一實施方案中，本發(fā)明關(guān)于從溶液純化蛋白質(zhì)的方法，其包含以下步驟或由 其組成：
[0122] (a)第一層析步驟，包含：
[0123] -使所述溶液通過第一層析膜吸附劑；
[0124] -使用第一洗脫緩沖液從第一層析膜吸附劑洗脫粗制蛋白質(zhì)洗脫液；
[0125] (b)第二層析步驟，包含：
[0126] -使在步驟（a)結(jié)束時所獲得的粗制蛋白質(zhì)洗脫液通過第二層析膜吸附劑；
[0127]-使用第二洗脫緩沖液從第二層析膜吸附劑洗脫蛋白質(zhì)洗脫物；和
[0128] (c)第三層析步驟，包含：
[0129] -使在步驟（b)結(jié)束時所獲得的蛋白質(zhì)洗脫物以流過模式通過第三層析膜吸附 劑；
[0130] -從第三層析膜吸附劑的流過液回收純化蛋白質(zhì)；
[0131] 其中所述緩沖液中的每一種都包含BisTris。
[0132] 更具體而言，上述兩個第一層析步驟中的每一個可包含以下步驟或由其組成：
[0133] -使平衡緩沖液通過層析膜吸附劑；
[0134] -使溶液或粗制蛋白質(zhì)洗脫液通過層析膜吸附劑（如上所述）；
[0135] -使平衡緩沖液通過層析膜吸附劑；
[0136] -任選地使洗滌緩沖液通過層析膜吸附劑；
[0137]-任選地使平衡緩沖液通過層析膜吸附劑；
[0138] -使用洗脫緩沖液從層析膜吸附劑洗脫粗制蛋白質(zhì)洗脫液或蛋白質(zhì)洗脫物（如上 所述），
[0139] 其中所述緩沖液中的每一種都包含BisTris。
[0140] 本發(fā)明還關(guān)于從溶液純化蛋白質(zhì)的方法，其包含以下步驟或由其組成：
[0141] (a)第一層析步驟，包含：
[0142] -使一部分所述溶液通過第一層析膜吸附劑；
[0143] -使用第一洗脫緩沖液從第一層析膜吸附劑洗脫粗制蛋白質(zhì)洗脫液，和
[0144] -任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第一層析膜吸附劑；
[0145] (b)第二層析步驟，包含：
[0146]-使在步驟（a)結(jié)束時所獲得的粗制蛋白質(zhì)洗脫液通過第二層析膜吸附劑，
[0147]-使用第二洗脫緩沖液從第二層析膜吸附劑洗脫蛋白質(zhì)洗脫物，和
[0148] -任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第二層析膜吸附劑；
[0149] (c)第三層析步驟，包含：
[0150] -使在步驟（b)結(jié)束時所獲得的蛋白質(zhì)洗脫物以流過模式通過第三層析膜吸附 劑，
[0151]-從第三層析膜吸附劑的流過液回收純化蛋白質(zhì)，和
[0152]-任選地使衛(wèi)生緩沖液通過第三層析膜吸附劑；
[0153] 使用另一部分溶液連續(xù)重新開始步驟（a)、（b)和（c)直至使用所有溶液，和
[0154] 收集在每一步驟（c)結(jié)束時所回收的純化蛋白質(zhì)；
[0155] 其中所述平衡緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液中的每一種都包含BisTris。
[0156] 如上文所示，上述本發(fā)明方法僅包含三個層析步驟。盡管本發(fā)明的方法僅包含三 個層析步驟，但其允許獲得適用于藥物目的且尤其適于至施用人的純化蛋白質(zhì)。
[0157] 除在純化過程中不存在人為操作（且由此減小完成所述純化過程所需的總時間） 外，所公開的方法還減小用于純化的緩沖液和樹脂的量。此外，主要緩沖液包含相同組份 (即BisTris、NaCl、乙酸、水和任選地NH4C1)，其大大促進了緩沖制備。除允許純化各種 mAb外，公開的純化方法還簡化mAb純化，改進總產(chǎn)率，并減少原材料、儲存設(shè)施、物質(zhì)成本 和過程時間。
[0158] 與上述慣用蛋白質(zhì)純化方法相比，本文公開的方法使用以下4種或5種緩沖液：平 衡緩沖液、洗滌緩沖液、兩種洗脫緩沖液和任選地衛(wèi)生緩沖液。公開的方法中所使用的4種 主要緩沖液使用相同化合物基質(zhì)從母液制得，其大大促進了緩沖液制備。
[0159] 如本文中所使用，"本發(fā)明的緩沖液"指包含BisTris的緩沖液。BisTris是本 領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的化合物，其IUPAC名稱為2-[雙（2-羥乙基）氨基]-2-(羥甲基） 丙烷-1，3-二醇，且其CAS編號為6976-37-0。這些本發(fā)明的緩沖液可對應(yīng)平衡緩沖液、洗 滌緩沖液和/或洗脫緩沖液。
[0160] 更具體而言，這些本發(fā)明的緩沖液可包含不同濃度的相同化學(xué)物質(zhì)（其中的一種 是BisTris)或由其組成。在一具體實施方案中，緩沖液包含BisTris、乙酸和水或由其組 成。在更具體的實施方案中，緩沖液包含BisTris、乙酸、NaCl、水和任選地NH4C1或由其組 成。換而言之，這些緩沖液包含不同濃度的BisTris、乙酸、NaCl、水和任選地NH4C1或由其 組成。
[0161] 洗脫緩沖液可例如包含15mM-25mM(例如20mM)BisTris和15mM-25mM(例如 20mM)NaCl或由其組成，其使用乙酸調(diào)節(jié)至pH介于3到4之間（例如3. 7)。該洗脫緩沖液 尤其適于與親和層析基質(zhì)、具體而言親和層析柱或膜吸附劑（例如蛋白質(zhì)A基質(zhì)、具體而言 蛋白質(zhì)A柱或蛋白質(zhì)A膜吸附劑）一起使用。
[0162]洗脫緩沖液還可包含 15mM-25mM(例如 20mM)BisTris、40mM-50mM(例如 45mM) NaCl和20mM-30mM(例如25mM)NH4Cl或由其組成，其使用乙酸調(diào)節(jié)至pH介于7到8之間 (例如7. 25)。該洗脫緩沖液尤其用于與多模式樹脂層析基質(zhì)、具體而言多模式樹脂層析柱 (例如CaptoMMC) -起使用。
[0163]洗脫緩沖液亦可包含 15mM-25mM(例如 20mM)BisTris、50mM-150mM(例如 80mM) NaCl及20mM-30mM(例如25mM)NH4Cl或由其組成，且使用乙酸調(diào)節(jié)至pH介于6與7之間 (例如6. 2)。這種洗脫緩沖液尤其用于與陽離子交換層析基質(zhì)、具體而言陽離子交換膜吸 附劑一起使用。
[0164]平衡緩沖液可包含 15mM-25mM(例如 20mM)BisTris和 15mM-25mM(例如 20mM) NaCl或由其組成，其使用乙酸調(diào)節(jié)至pH介于7到8之間（例如7. 4)。
[0165]洗滌緩沖液可包含 15mM-25mM(例如 20mM)BisTris和0·9M-1. 1M(例如lM)NaCl 或由其組成，其使用乙酸調(diào)節(jié)至pH介于7到8之間（例如7. 4)。
[0166] 更具體而言，一種用于所公開的方法中的平衡緩沖液含有20mMBisTris和20mM NaCl，且使用2mM乙酸調(diào)節(jié)至pH7. 4。一種用于所公開的方法中的洗滌緩沖液含有20mM BisTris和1MNaCl，且使用2mM乙酸調(diào)節(jié)至pH7. 4。用于所公開的方法中的第一洗脫緩 沖液含有20mMBisTris和20mMNaCl，且使用275mM乙酸調(diào)節(jié)至pH3. 7。用于公開的方法 中的第二洗脫緩沖液含有20mMBisTris、45mMNaCl和25mMNH4C1且使用5mM乙酸調(diào)節(jié)至 pH7. 25(尤其用于與多模式樹脂層析柱一起使用），或含有20mMBisTris、80mMNaCl和 25mMNH4C1且使用5mM乙酸調(diào)節(jié)至pH6. 2(尤其用于與陽離子交換膜吸附劑一起使用）。
[0167] 上述緩沖配制物的優(yōu)點包含mAb產(chǎn)物能夠通過具有較大兼容性的用于所公開的 方法中的三種層析基質(zhì)、具體而言三種層析柱或三種層析膜吸附劑，同時最小化不期望的 相互作用，限制pH及電導(dǎo)率降低，并促進與傳統(tǒng)純化方法相比增加的產(chǎn)率。除使用數(shù)量減 少的緩沖液外，所公開的方法的另一方面是使用Bis-Tris緩沖液。使用這種緩沖液避免在 三個層析步驟之間調(diào)節(jié)pH且由此使得能夠在閉合系統(tǒng)中自收獲至最后純化步驟運行該方 法。
[0168] 任選地用于本發(fā)明的上下文中的衛(wèi)生緩沖液可包含0.05N至0.15N(例如0.1N) NaOH或由其組成。這種衛(wèi)生緩沖液尤其適于與下列一起使用：親和層析基質(zhì)，具體而言親 和層析柱例如蛋白質(zhì)A柱，或親和層析膜吸附劑例如Sartobind蛋白質(zhì)A膜吸附劑，多模式 樹脂或陽離子交換層析基質(zhì)，具體而言多模式樹脂層析柱，例如CaptoMMC，或陽離子交換 層析膜吸附劑，例如SartobindS膜吸附劑，和/或陰離子交換層析基質(zhì)，具體而言陰離子 交換層析柱，例如BioProQ75,或陰離子交換層析膜吸附劑，例如SartobindQ膜吸附劑。
[0169] 本文所用的術(shù)語"多肽"或"蛋白質(zhì)"指：
[0170] 1)具有天然蛋白序列的分子，即a)通過天然存在和具體而言非重組細胞產(chǎn)生的 蛋白質(zhì)，或b)通過基因改造或重組細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或
[0171] 2)因一個或多個氨基酸的缺失、添加和/或取代和/或因至少一種翻譯后修飾 (例如糖基化）而與天然蛋白的序列有所不同的分子。
[0172] 在上文段落1)中所提及的分子可稱為天然蛋白。
[0173] 在上文段落2)中所提及的分子是非天然蛋白。
[0174] 在某些方面中，待純化蛋白是抗體。
[0175] 本文所用的術(shù)語"抗體"指完整抗體或與完整抗體競爭特異性結(jié)合的其結(jié)合片段。 結(jié)合片段包括但不限于F(ab)、F(ab' )、F(ab' )2、Fv和單鏈抗體。術(shù)語"重鏈"包括具有 足夠可變區(qū)序列以賦予抗原特異性的任一免疫球蛋白多肽。
[0176] 本文所用的術(shù)語"重鏈"涵蓋全長重鏈及其片段。全長重鏈包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域VH 和三個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。VH結(jié)構(gòu)域位于多肽的氨基末端處，且CH3結(jié)構(gòu)域位 于羧基末端處。
[0177] 本文所用的術(shù)語"輕鏈"涵蓋全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域VL 和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CL。如同重鏈，輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域位于多肽的氨基末端處。本文所用的 術(shù)語"輕鏈"包括具有足夠可變區(qū)序列以賦予抗原特異性的任一免疫球蛋白多肽。
[0178] 天然存在的抗體結(jié)