用于使用N-末端截短的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶變體的糖蛋白的單-和二唾液酸 ...的制作方法
【專利說明】用于使用N-末端截短的β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn) 移酶變體的糖蛋白的單-和二唾液酸化的方法
[0001] 本公開涉及具有Ν-末端截短缺失的某些糖基轉(zhuǎn)移酶變體的用途。發(fā)現(xiàn)人β-半 乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(hST6Gal_I)的兩種不同的截短變體的組合表現(xiàn)出不同的 唾液酸轉(zhuǎn)移酶比活性。在一個例子中，在其中第一變體Λ89hST6Gal-I催化雙唾液酸化目 標分子的形成的條件下，第二變體Λ108hST6Gal-I催化單唾液酸化目標分子的形成。因 此，公開了哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶的變體，編碼其的核酸，用于重組產(chǎn)生哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶 的變體的方法和方式及其用途，特別是用于以定量受控方式唾液酸化作為糖蛋白諸如免疫 球蛋白的部分的聚糖部分的末端受體基團的用途。
[0002] 置量 轉(zhuǎn)移酶（EC2)催化官能團從一種物質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一種物質(zhì)。糖基轉(zhuǎn)移酶，酶的一個超家 族，參與合成糖蛋白、糖脂和糖胺聚糖的碳水化合物部分。特定糖基轉(zhuǎn)移酶通過將活化的糖 供體的單糖部分的相繼轉(zhuǎn)移至受體分子來合成寡糖。因此，"糖基轉(zhuǎn)移酶"催化糖部分從其 核苷酸供體轉(zhuǎn)移至多肽、脂質(zhì)、糖蛋白或糖脂的受體部分。該過程也被稱為"糖基化"。作為 例如糖蛋白的結(jié)構(gòu)部分的碳水化合物部分也被稱為"聚糖"。聚糖構(gòu)成最流行的所有已知的 翻譯后蛋白修飾。聚糖參與和粘附、免疫應(yīng)答、神經(jīng)細胞迀移和軸突延伸一樣多樣的廣泛系 列的生物識別過程。作為糖蛋白的結(jié)構(gòu)部分，聚糖也在蛋白折疊和蛋白穩(wěn)定性和生物活性 的支持中具有作用。
[0003] 在糖基轉(zhuǎn)移酶催化中，單糖單元葡萄糖（Glc)、半乳糖（Gal)、N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc)、葡糖醛酸（GlcUA)、半乳糖醛酸（GalUA)和木糖被活 化為尿苷二磷酸（UDP)-a-D衍生物；阿拉伯糖被活化為UDP-β-L衍生物；甘露糖（Man)和 巖藻糖分別被活化為⑶P-a-D和⑶P-β-L衍生物；且唾液酸（=Neu5Ac;=SA)被活化為 β-D-Neu5Ac的CMP衍生物。
[0004] 許多不同的糖基轉(zhuǎn)移酶有助于聚糖的合成。糖蛋白的碳水化合物部分的結(jié)構(gòu)多 樣性特別大，且通過復(fù)雜的生物合成途徑來確定。在真核生物中，糖蛋白的聚糖-部分的 生物合成發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（"ER"）和高爾基體的內(nèi)腔中。糖蛋白的單一（支鏈或直鏈）碳 水化合物鏈通常是N-或0-連接的聚糖。在翻譯后加工過程中，碳水化合物通常經(jīng)由天冬 酰胺（"N-連接的糖基化"），或經(jīng)由絲氨酸或蘇氨酸（"0-連接的糖基化"）連接至多肽。 聚糖的合成(無論N-連接或0-連接（="N-/0-連接的"））由幾種不同的膜錨定的糖基轉(zhuǎn) 移酶的活性影響。糖蛋白可以包含一個或多個聚糖連接的氨基酸（="糖基化位點"）。特 定聚糖結(jié)構(gòu)可以是直鏈或支鏈的。支鏈是碳水化合物的顯著特征，其與DNA、RNA和多肽 通常的線性性質(zhì)相反。與它們的基本構(gòu)建塊的大異質(zhì)性組合，單糖，多糖結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出高多 樣性。此外，在特別的糖蛋白種類的成員中，連接至特定糖基化位點的聚糖的結(jié)構(gòu)可以變 化，因此導(dǎo)致各自糖蛋白種類（即，共享多肽部分的相同氨基酸序列的種類）的微異質(zhì)性 (microheterogeneity)。
[0005] 唾液酸轉(zhuǎn)移酶（="ST"）是催化唾液酸（=5-N-乙酰神經(jīng)氨酸=Neu5Ac=NANA) 殘基從供體化合物轉(zhuǎn)移至（i)糖脂或神經(jīng)節(jié)苷脂的末端單糖受體基團或（ii)糖蛋白的 N-/0-連接的聚糖的末端單糖受體基團的糖基轉(zhuǎn)移酶。對于哺乳動物唾液酸轉(zhuǎn)移酶(其包 括人ST種類)，存在作為胞苷-5' -單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸（=CMP-Neu5Ac=CMP-NANA) 的共同供體化合物。唾液酸殘基的轉(zhuǎn)移也被稱為"唾液酸化（sialylating) "和"唾液酸化 (sialylation) '，。
[0006] 在唾液酸化的糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)中，通常在寡糖的末端位置中發(fā)現(xiàn)（一個或多 個）唾液酸部分。由于所述末端（即暴露位置)，唾液酸可以參與許多不同的生物識別現(xiàn)象且 服務(wù)于不同種類的生物相互作用。在糖蛋白中，可以存在多于一個唾液酸化位點，即能夠充 當(dāng)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的底物且作為適合于唾液酸殘基的轉(zhuǎn)移的受體基團的位點。此類多于一個 位點原則上可以是錨定在糖蛋白的不同的糖基化位點的多個線性聚糖部分的末端。此外， 支鏈聚糖可以具有其中可以發(fā)生唾液酸化的多個位點。
[0007] 根據(jù)目前知識，可以發(fā)現(xiàn)末端唾液酸殘基（i)α2 - 3 (α2, 3)連接至半乳糖 基-R，（ii)α2 -6(α2,6)連接至半乳糖基-R，（iii)α2 -6(α2,6)連接至Ν-乙酰半 乳糖胺基_R，（iv)α2 - 6 (α2, 6)連接至Ν-乙酰葡糖胺基-R，和（ν)α2 - 8/9 (α2, 8/9) 連接至唾液酸基（sialidyl)-R，其中-R表示受體底物部分的其余部分。因此，唾液酸綴合 物的生物合成（="唾液酸化"）中有活性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶通常根據(jù)其各自的單糖受體底物 且根據(jù)其催化的糖苷鍵的3、6或8/9位置進行命名和分類。因此，在本領(lǐng)域已知的文獻中， 例如在PatelRY,等人，Glycobiology16 (2006) 108-116 中，根據(jù)轉(zhuǎn)移Neu5Ac殘基、 同時形成糖苷鍵的受體糖殘基的羥基位置，參考真核生物唾液酸轉(zhuǎn)移酶，諸如（i)ST3Gal， (ii)ST6Gal，（iii)ST6GalNAc，或（v)ST8Sia。也可以更通用的方式參考唾液酸轉(zhuǎn)移 酶，例如，作為ST3、ST6、ST8 ;因此，"ST6"明確涵蓋催化α2, 6唾液酸化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
[0008] 二糖部分β-D-半乳糖基-1，4-Ν-乙?；?β-D-葡糖胺（=Galβ1，4GlcNAc)是 糖蛋白的N-連接的聚糖的觸角（antennae)的常見末端殘基，但也可以存在于0-連接的聚 糖和糖脂中。酶β-半乳糖苷-α2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（="ST6Gal"）能夠催化聚糖的末端 Galβ1，4GlcNAc或聚糖的支鏈（="觸角（antennae) "）的α2, 6-唾液酸化。對于其一般 方面，參考DallOlioF.GlycoconjugateJournal17 (2000) 669-676 的文獻。在人和其 它哺乳動物中，似乎存在幾種ST6Gal。本公開特別涉及人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn) 移酶I(=hST6Gal-I;根據(jù)IUBMB酶命名法，EC2. 4. 99. 1)，但不限于此。
[0009] 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的ST6組包含2個亞組，ST6Gal和ST6GalNAc。ST6Gal酶的活性催 化Neu5Ac殘基轉(zhuǎn)移至作為聚糖的末端Galβ1，4GlcNAc的部分或聚糖的觸角的游離半乳糖 基殘基的C6羥基，從而在聚糖中形成α2 - 6連接至Galβ1，4GlcNAc部分的半乳糖基殘 基的末端唾液酸殘基。聚糖中所得新形成的末端部分是Neu5Acα2, 6Galβ1，4GlcNAc。
[0010] 人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(hST6Gal-I)的野生型多肽在本文獻 申請時在公開可得的NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/115445)中被 公開為"1]11丨?仰丨1?/3?丨^^^的：？15907.1"。包括編碼序列的進一步信息被提供為數(shù)據(jù)庫 條目"GeneID:6480" 內(nèi)編譯的超鏈接（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6480)。
[0011] 哺乳動物唾液酸轉(zhuǎn)移酶與其它哺乳動物高爾基體駐留的（Golgi-resident)糖基 轉(zhuǎn)移酶共享所謂的"II型構(gòu)造（typeIIarchitecture)"，其具有（i)短胞質(zhì)N-末端尾部， (ii)跨膜片段，隨后為（iii)可變長度的莖區(qū)域和（iv)面向高爾基體的內(nèi)腔的C-末端 催化結(jié)構(gòu)域（DonadioS.等人inBiochimie85 (2003) 311-321)。哺乳動物唾液酸轉(zhuǎn)移 酶表現(xiàn)出在它們的催化結(jié)構(gòu)域中展示顯著的序列同源性。
[0012] DonadioS.等人在CH0細胞中表達hST6Gal_I的幾種N-末端截短的變體，且發(fā)現(xiàn) 包含前35、48、60和89個氨基酸的N-末端缺失產(chǎn)生突變酶，然而其在將唾液酸轉(zhuǎn)移至外源 受體中仍然具有活性。
[0013] 糖基化是影響蛋白折疊、穩(wěn)定性和生物活性的調(diào)節(jié)的蛋白的重要的翻譯后修飾。 唾液酸部分（=唾液酸，5-N-乙酰神經(jīng)氨酸，Neu5Ac)通常暴露于N-糖基化的末端位置并因 此，是對于生物識別和配體功能的重要貢獻因素，例如，特征在于末端唾液酸的IgG被顯示 誘導(dǎo)更少的炎癥反應(yīng)和增加的血清半衰期。
[0014] 使用糖基轉(zhuǎn)移酶用于酶促合成定義的聚糖結(jié)構(gòu)正成為引導(dǎo)治療性蛋白諸如抗 體的N-糖基化的工具。由于原核生物來源的糖基轉(zhuǎn)移酶通常不對復(fù)雜糖蛋白結(jié)構(gòu)起作 用，所以哺乳動物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶是優(yōu)選的。例如，Barb等人（2009)使用分離的人 ST6Gal-I制備免疫球蛋白G的Fc片段的高度有效的唾液酸化的形式。然而，由于在各種 宿主（畢赤酵母（Pichiapastoris)、草地貪夜蛾（Spodopterafrugiperda)和大腸桿菌） 中的低表達和/或不良活性，重組ST6Gal-I用于治療應(yīng)用仍然受限。
[0015] 本領(lǐng)域已知的是，哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶可以有利地用于在體外唾液酸化復(fù)雜的目 標分子諸如糖蛋白或糖脂的觸角受體位點。然而，仍然缺乏以定量控制的方式進行唾液酸 化（特別是關(guān)于具有兩個或更多個能夠被唾液酸化的受體位點的目標分子）的手段和方 法。也就是說，期望提供了與唾液酸化目標分子的兩個或更多個或甚至所有受體位點相反， 允許唾液酸化幾個受體位點中的僅一個的方式、方法和條件。進一步期望在批次唾液酸化 反應(yīng)混合物中控制目標分子的單事件唾液酸化及其多事件唾液酸化之間的平衡。
[0016] 令人驚訝地，最初發(fā)現(xiàn)兩種截短變體Λ89hST6Gal-I和Λ108hST6Gal-I表現(xiàn)出不 僅對抗體、而且對其它目標分子的不同的體外唾液酸化活性。顯然，IgG-Fc觸角聚糖G2在 可以被唾液酸化的分枝的末端具有兩個半乳糖部分。在相同的反應(yīng)條件下，Λ89hST6Gal-I 優(yōu)選催化雙唾液酸化聚糖（G2 + 2SA)的合成，而變體Λ108hST6Gal-I合成單唾液酸化聚 糖（G2 + 1SA)。因此，兩種酶都是適合用于聚糖結(jié)構(gòu)、特別是N-聚糖的選擇性唾液酸化的 工具。
[0017] 本發(fā)明人的最初發(fā)現(xiàn)是人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I的Δ108 hST6Gal_I變體主要能夠?qū)H單一唾液酸殘基添加至具有兩個或更多個觸角受體位點 的目標分子。相比之下，人β-半乳糖苷-α_2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I及其特定變體諸如 八89 1^了66&1-1的酶促活性導(dǎo)致目標分子的多重唾液酸化。因此，借助使用單獨的六108 hST6Gal_I，例如在分批處理中，單-唾液酸化的目標分子可以從具有兩個或更多個非唾液 酸化的觸角受體位點的目標分子產(chǎn)生。
[0018] 這為許多不同的方法、特別是在體外糖工程改造免疫球蛋白和還有其它糖基化的 目標分子的領(lǐng)域中鋪平了道路。此處，具體地和示例性地提供了導(dǎo)致產(chǎn)生單唾液酸化和雙 唾液酸化的免疫球蛋白G分子的方法，其中其比率借助控制（i)Λ108hST6Gal-I酶促活性 和（ii)能夠以飽和方式唾液酸化目標分子的受體位點的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸 轉(zhuǎn)移酶I的酶促活性的量來控制。然而，定量唾液酸化控制待唾液酸化的目標分子的許多 其它體外唾液酸化方法變得可行，且可以從本公開內(nèi)容來推斷。
[0019] 在一個具體實施方案中，本文獻公開了通過在ΗΕΚ293細胞中瞬時基因表達而高 產(chǎn)量表達人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(hST6Gal-I，EC2. 4. 99. 1 ;數(shù)據(jù)庫條 目P15907)的兩種不同變體，其中產(chǎn)率高達100mg/L。發(fā)現(xiàn)兩種變體的特征在于令人驚訝 不同的唾液酸化活性。
[0020] 概述 在第一個方面，在此公開了SEQIDN0:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾 液酸轉(zhuǎn)移酶I(A108hST6Gal-I)用于從目標分子特異性形成