單唾液酸化目標(biāo)分子的用 途，其中所述目標(biāo)分子選自糖蛋白或糖脂，其中所述目標(biāo)分子包含多個(gè)觸角目標(biāo)部分，所述 觸角目標(biāo)部分具有作為末端結(jié)構(gòu)的在半乳糖基殘基中的C6位置具有羥基的β-D-半乳糖 基-1，4-Ν-乙?；?β-D-葡糖胺部分，其中所述單-唾液酸化目標(biāo)分子包含單一唾液酸 化末端觸角目標(biāo)部分，且其中所述唾液酸化末端觸角目標(biāo)部分包含一個(gè)Ν-乙酰神經(jīng)氨酰 基-α2, 6-β-D-半乳糖基-1，4-Ν-乙?；?β-D-葡糖胺殘基。
[0021] 在進(jìn)一步的方面中，公開(kāi)了用于體外產(chǎn)生具有添加至目標(biāo)分子的一個(gè)觸角末端結(jié) 構(gòu)的單一唾液酸殘基的唾液酸化目標(biāo)分子的方法，所述方法包括以下步驟：(a)提供組合 物，所述組合物包含（i)目標(biāo)分子，所述目標(biāo)分子選自糖蛋白和糖脂，所述目標(biāo)分子包含多 個(gè)觸角，所述觸角中的至少兩個(gè)各自具有作為末端結(jié)構(gòu)的在半乳糖基殘基中的C6位置具 有羥基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙?；?β-D-葡糖胺部分；（ii)SEQIDN0:3的N-末端 截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ι(Λ108hST6Gal-I) 胞苷-5'-單磷 酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸或其功能等效物，作為用于唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)的供體化合物； (b)在允許糖基轉(zhuǎn)移酶酶促活性的條件下溫育步驟（a)的組合物，從而每個(gè)目標(biāo)分子形成 單一末端觸角N-乙酰神經(jīng)氨酰基-α2, 6-β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺 殘基（=α2, 6唾液酸化末端觸角殘基）；從而體外產(chǎn)生具有添加至目標(biāo)分子的一個(gè)觸角末 端結(jié)構(gòu)的單一唾液酸殘基的唾液酸化目標(biāo)分子。
[0022] 在還進(jìn)一步的方面中，公開(kāi)了選自糖蛋白和糖脂的單-唾液酸化目標(biāo)分子，所述 單-唾液酸化目標(biāo)分子可通過(guò)如本文公開(kāi)的方法獲得。
[0023] 在還進(jìn)一步的方面中，公開(kāi)了包含允許糖基轉(zhuǎn)移酶酶促活性的水性緩沖劑的組合 物，所述組合物進(jìn)一步包含：(a)糖基化目標(biāo)分子，所述目標(biāo)分子選自糖蛋白和糖脂，所述 目標(biāo)分子包含多個(gè)觸角，所述觸角中的至少兩個(gè)各自具有作為末端結(jié)構(gòu)的在半乳糖基殘基 中的C6位置具有羥基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙?；?β-D-葡糖胺部分；(b)SEQID NO: 2的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(Δ89hST6Gal-I)或具 有高于或等于A89hST6Gal-I的酶促活性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶酶促活性的可溶性N-末端截 短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I變體；（c)SEQIDΝ0:3的Ν-末端截短的人 β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(Δ108hST6Gal_I) ; (d)胞苷-5' -單磷酸-N-乙 酰神經(jīng)氨酸或其功能等效物，作為用于唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)的供體化合物。
[0024] 在還進(jìn)一步的方面中，公開(kāi)了如本文公開(kāi)的組合物用于在體外和允許糖基轉(zhuǎn)移酶 酶促活性的條件下產(chǎn)生具有添加至目標(biāo)分子的一個(gè)或多個(gè)觸角末端結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)唾 液酸殘基的唾液酸化目標(biāo)分子的用途。
[0025] 在還進(jìn)一步的方面中，公開(kāi)了用于體外產(chǎn)生具有受控量的添加至目標(biāo)分子的一個(gè) 或多個(gè)觸角末端結(jié)構(gòu)的唾液酸殘基的唾液酸化目標(biāo)分子的方法，所述目標(biāo)分子選自糖蛋白 和糖脂，所述目標(biāo)分子包含多個(gè)觸角，所述觸角中的至少兩個(gè)各自具有作為末端結(jié)構(gòu)的在 半乳糖基殘基中的C6位置具有羥基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙?；?β-D-葡糖胺部 分，所述方法包括以下步驟：(a)提供如本文公開(kāi)的組合物；(b)在允許糖基轉(zhuǎn)移酶酶促活 性的條件下且持續(xù)預(yù)定時(shí)間間隔溫育步驟（a)的組合物，從而形成末端觸角N-乙酰神經(jīng)氨 ?；?α2, 6-β-D-半乳糖基-1，4-N-乙?；?β-D-葡糖胺殘基[=α2, 6唾液酸化末端觸 角殘基];其中Α89hST6Gal_I催化雙唾液酸化IgG的形成且Δ108hST6Gal_I催化單唾 液酸化IgG的形成，從而體外產(chǎn)生具有受控量的添加至目標(biāo)分子的一個(gè)或多個(gè)觸角末端結(jié) 構(gòu)的唾液酸殘基的唾液酸化目標(biāo)分子。
[0026] 在還進(jìn)一步的方面中，公開(kāi)了糖基化的目標(biāo)分子的制備物，所述目標(biāo)分子為IgG 亞類(lèi)的免疫球蛋白分子，其中所述制備物中的單和雙唾液酸化的目標(biāo)分子的量是受控量， 所述制備物通過(guò)如本文公開(kāi)的方法獲得。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1純化的HEK細(xì)胞中表達(dá)的重組hST6Gal-I變體的SDS-PAGE。泳道1和4 :分 子量標(biāo)記物；泳道2 :將5 純化的酶Λ108hST6Gal_I上樣至凝膠；泳道3 :將5 純化 的酶Λ89hST6Gal-I上樣至凝膠上。
[0028] 圖2使用重組Λ89hST6Gal-I唾液酸化脫唾液酸MABIgG4的時(shí)程。顯示具有末 端半乳糖殘基的聚糖（G2+0SA，"脫唾液酸"）、單唾液酸化的聚糖（G2+1SA)和雙唾液酸化的 聚糖（G2+2SA)的相對(duì)含量。
[0029] 圖3使用重組Δ108hST6Gal_I唾液酸化脫唾液酸MABIgG4的時(shí)程。顯示具有 末端半乳糖殘基的聚糖（G2+0SA;"脫唾液酸")、單唾液酸化的聚糖（G2+1SA)和和雙唾液酸 化的聚糖（G2+2SA)的相對(duì)含量。
[0030] 詳述 術(shù)語(yǔ)"一個(gè)/種（a) "、"一個(gè)/種（an)"和"該（the)"通常包括復(fù)數(shù)對(duì)象，除非上下文 另有清楚指出。如本文所使用，"多個(gè)/種"被理解為是指多于一個(gè)/種。例如，多個(gè)/種是 指至少兩個(gè)/種、三個(gè)/種、四個(gè)/種、五個(gè)/種或更多個(gè)/種。除非特別說(shuō)明或從上下文 顯而易見(jiàn)，如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"或"被理解為是包括性的。
[0031] 除非特別說(shuō)明或從上下文顯而易見(jiàn)，如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"約"被理解為在本領(lǐng)域 中的正常公差的范圍內(nèi)，例如在平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。約可以被理解為在所示值的 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 5%、0· 1%、0· 05% 或 0· 01% 內(nèi)。除非從上下文另外清 楚，本文提供的所有數(shù)值可以通過(guò)術(shù)語(yǔ)約進(jìn)行修飾。
[0032] 術(shù)語(yǔ)"氨基酸"通常是指可以摻入肽、多肽或蛋白的任何單體單位。如本文所使 用，術(shù)語(yǔ)"氨基酸"包括下列二十種天然或遺傳編碼的α-氨基酸：丙氨酸（Ala或A)、精氨 酸（Arg或R)、天冬酰胺（Asn或N)、天冬氨酸（Asp或D)、半胱氨酸（Cys或C)、谷胺酰胺（Gin 或Q)、谷氨酸（Glu或E)、甘氨酸（Gly或G)、組氨酸（His或H)、異亮氨酸（lie或I)、亮氨酸 (Leu或L)、賴(lài)氨酸（Lys或K)、甲硫氨酸（Met或M)、苯丙氨酸（Phe或F)、脯氨酸（Pro或P)、 絲氨酸（Ser或S)、蘇氨酸（Thr或T)、色氨酸（Trp或W)、酪氨酸（Tyr或Y)和纈氨酸（Val或 V)。在其中"X"殘基未定義的情況下，這些應(yīng)該定義為"任何氨基酸"。這二十種天然氨基酸 的結(jié)構(gòu)顯不于例如Stryer等人，Biochemistry,第5版，F(xiàn)reemanandCompany(2002)。 額外的氨基酸，諸如硒代半胱氨酸和吡咯賴(lài)氨酸，也可以被遺傳編碼（Stadtman(1996) "Selenocysteine，"AnnuRevBiochem. 65:83-100和Ibba等人（2002)"Geneticcode:introducingpyrrolysine，"CurrBiol. 12(13) :R464_R466)D 術(shù)語(yǔ)"氨基酸"還包括非天 然氨基酸、修飾的氨基酸（例如，具有修飾的側(cè)鏈和/或骨架）和氨基酸類(lèi)似物。參見(jiàn)，例如 Zhang等人(2004)αSelectiveincorporationof5-hydroxytryptophanintoproteins inmammaliancells，"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101(24):8882-8887,Anderson 等人(2004)"Anexpandedgeneticcodewithafunctionalquadrupletcodon" Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101 (20):7566-7571,Ikeda等人（2003)"Synthesis ofanovelhistidineanalogueanditsefficientincorporationintoaprotein invivo，"ProteinEng.Des.Sel. 16(9):699-706,Chin等人（2003)"AnExpanded EukaryoticGeneticCode，"Science301 (5635):964-967,James等人（2001)"Kinetic characterizationofribonucleaseSmutantscontainingphotoisomerizable phenylazophenylalanineresidues，''ProteinEng.Des.Sel. 14 (12) : 983-991， Kohrer等人(2001)αImportofamberandochresuppressortRNAsintomammalian cells:Ageneralapproachtosite-specificinsertionofaminoacidanalogues intoproteins,^Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 98(25):14310-14315,Bacher 等人(2001)"SelectionandCharacterizationofEscherichiacoliVariants CapableofGrowthonanOtherwiseToxicTryptophanAnalogue， "J.Bacteriol. 183(18):5414_5425，Hamano-Takaku等人（2000)"AMutantEscherichiacoli Tyrosyl-tRNASynthetaseUtilizestheUnnaturalAminoAcidAzatyrosineMore EfficientlythanTyrosine，"J.Biol.Chem. 275 (51):40324_40328， 和Budisa 等人(2001)αProteinswith{beta}-(thienopyrrolyl)alaninesasalternative chromophoresandpharmaceuticallyactiveaminoacids， "ProteinSci. 10(7):1281-1292^為了進(jìn)一步說(shuō)明，氨基酸通常為包括取代的或未取代的氨基、取代的或 未取代的羧基和一種或多種側(cè)鏈或基團(tuán)，或這些基團(tuán)的任一種的類(lèi)似物的有機(jī)酸。示例性 側(cè)鏈包括，例如巰基、硒基、磺?；?、烷基、芳基、?；?、酮基、疊氮基、羥基、肼、氰基、鹵素、酰 肼、烯基、炔基、醚基、硼酸酯（borate)、硼酸鹽（boronate)、二氧磷基、膦?；㈧?、雜環(huán)、稀 酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺或這些基團(tuán)的任何組合。其它代表性氨基酸包括但不限于， 包含光敏交聯(lián)劑的氨基酸、金屬結(jié)合氨基酸、自旋標(biāo)記的氨基酸、熒光氨基酸、含有金屬的 氨基酸、具有新型官能團(tuán)的氨基酸、與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸、對(duì)光不穩(wěn) (photocaged)和/或可光異構(gòu)化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素類(lèi)似物的 氨基酸、糖基化的氨基酸、其它碳水化合物修飾的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、 重原子取代的氨基酸、化學(xué)可切割的和/或光可切割的氨基酸、含有碳連接糖的氨基酸、氧 化還原活性氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和包含一個(gè)或多個(gè)毒性部分的氨基酸。
[0033] 術(shù)語(yǔ)"蛋白"是指作為核糖體翻譯過(guò)程的產(chǎn)物的多肽鏈（氨基酸序列），其中所述 多肽鏈已經(jīng)經(jīng)歷翻譯后折疊過(guò)程，產(chǎn)生三維蛋白結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)"蛋白"還涵蓋具有一種或多種 翻譯后修飾諸如（但不限于）糖基化、磷酸化、乙酰化和泛素化的多肽。
[0034] 如本文公開(kāi)的任何蛋白、特別是如本文公開(kāi)的重組產(chǎn)生的蛋白，在一個(gè)具體實(shí)施 方案中可以包括"蛋白標(biāo)簽"，其為遺傳上接枝（grafted)至重組蛋白上的肽序列。蛋白標(biāo) 簽可以包含具有促進(jìn)通過(guò)蛋白水解去除標(biāo)簽的特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的接頭序列。作為一 個(gè)具體實(shí)施方案，"親和標(biāo)簽"被附加至目標(biāo)蛋白，使得可以使用親和技術(shù)從其粗生物來(lái)源 純化目標(biāo)。例如，所述來(lái)源可以是表達(dá)目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主生物體或由轉(zhuǎn)化的宿主生