CMV)立即早期增強(qiáng)子/啟動子區(qū)域的控制下，隨后為用于調(diào)節(jié)表達(dá)的內(nèi)含子A，和 BGH多腺苷酸化信號。
[0109] 如實施例8中所述執(zhí)行在HEK細(xì)胞中表達(dá)上述構(gòu)建體，和使變體hST6Gal_I蛋白 分泌至細(xì)胞上清液。
[0110] 實施例8 轉(zhuǎn)化HEK細(xì)胞和瞬時表達(dá)和分泌 通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA的瞬時基因表達(dá)（TGE)是在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白的快 速策略。對于重組人蛋白的高水平表達(dá)，使用基于懸浮適應(yīng)的人胚胎腎（HEK) 293細(xì)胞系 的TGE平臺。在搖瓶中在37°C在無血清培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)制造商的指南用通 過293-Free? (Merck)轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合的pMIMT表達(dá)質(zhì)粒（0· 5至1mg/L細(xì)胞培養(yǎng)物）以 約2x106vc/ml轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后三小時，添加丙戊酸（HDAC抑制劑）（最終濃度4mM)， 以便加強(qiáng)表達(dá)（Backliwal等人（2008)，NucleicAcidsResearch36，e96)。每天，用 6% (v/V)的基于大豆蛋白胨水解產(chǎn)物的給料補(bǔ)充培養(yǎng)物。在轉(zhuǎn)染后第7天通過離心收集培養(yǎng) 上清液。
[0111] 實施例9 從HEK細(xì)胞純化重組人ST6Gal-I變體 使用簡化的純化方案從HEK細(xì)胞發(fā)酵的上清液純化hST6Gal-I的不同變體 (Ερ〇-ΑΡ-Δ89hST6Gal-I和Ep〇-APPR-A108hST6Gal-I)。在第一步驟中，過濾（0.2Mm) 0.1升培養(yǎng)上清液，將溶液針對緩沖液A(20mM磷酸鉀，pH6. 5)進(jìn)行透析。將透析物上 樣至用緩沖液A平衡的S-Sepharoseff柱（1.6cmX2cm)。用100ml緩沖液A洗滌之 后，用10ml緩沖液A和10ml緩沖液A+ 200mMNaCl的線性梯度，隨后使用48ml緩沖 液A+ 200mMNaCl的洗滌步驟，洗脫酶。通過分析SDS凝膠電泳分析級分（4ml)。合并 含有該酶的級分，且針對緩沖液B(50mMMES，pH6.0)進(jìn)行透析。將透析合并物上樣至用 緩沖液B平衡的肝素瓊脂糖ff柱（0.5cmX5cm)，且使用緩沖液B+ 200mMNaCl進(jìn) 行洗脫。合并含有該酶的級分（1ml)，且針對緩沖液B進(jìn)行透析。在280nm確定蛋白濃 度（對于Δ89ST6Gal-I，E280nm[10mg/ml]=l·931，對于Δ108ST6Gal-I，E280nm[10 mg/ml] = 1. 871)。該酶的質(zhì)譜法分析顯示，表達(dá)不具有N-末端氨基酸AP的Ερο-ΑΡ-Λ89 hST6Gal-I的構(gòu)建體。該令人驚訝的發(fā)現(xiàn)表明信號肽酶對表達(dá)的蛋白的不尋常的切割。對 于構(gòu)建體Epo-APPR-Λ108hST6Gal-I，將N-末端序列驗證為APPR，表明預(yù)期的信號肽對 EPO信號序列的切割。對于來自HEK細(xì)胞的重組人Λ108hST6Gal-I，確定了 >600RFU/mg的比活性。變體Λ89hST6Gal-I顯示>1100RFU/mg的增加的比活性。
[0112] 圖1顯示了來自HEK細(xì)胞的純化的重組hST6Gal-I變體的SDS-PAGE的結(jié)果。
[0113] 實施例10 唾液酸化人源化單克隆抗體（MAB) 高度半乳糖化的人源化單克隆抗體MABIgG4 (W0 2005/023872)用于唾液酸化實驗 中。反應(yīng)混合物含有MABIgG4 (300Pg/55μL35mM乙酸鈉/Tris緩沖液pH7. 0)、供體 底物CMP-ΝΑΝΑ(150Pg/50μL水）和唾液酸轉(zhuǎn)移酶（30Pg/20mM磷酸鉀，0· 1MNaCl, pH6. 5)。將樣品在37°C溫育定義時間。為了停止反應(yīng)，將100μL變性緩沖液（6Μ鹽酸 胍）和30μLTCEP(0. 1mM，稀釋于變性緩沖液中）添加至樣品，且將樣品在37°C溫育1小 時。使用預(yù)平衡的illustra?Nap5_Columns(GE-Healthcare)將該樣品緩沖于電噴霧介 質(zhì)（20 %ACN，1 %FA)中。通過電噴霧離子化質(zhì)譜法分析樣品，且確定G2+0SA、G2+1SA和 G2+2SAN-聚糖的含量。使用MicromassQ-TofUltima和SynaptG2HDMS設(shè)備（Waters UK)，且使用的軟件是MassLynxV4.1。為了確定唾液酸化的動力學(xué)，將反應(yīng)物溫育長達(dá)8 小時。
[0114] 通過質(zhì)譜法確定G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA的含量。圖2顯示在與89hST6Gal-I溫 育期過程中的不同時間點后A獲得的差異唾液酸化的目標(biāo)蛋白的相對量。對于變體Λ89 hST6Gal-I，已經(jīng)在溫育2小時之后，獲得高含量（88% )的雙唾液酸化的形式G2+2SA，參見 圖2。數(shù)據(jù)還顯示，G2+2SA的含量在延長溫育8小時之后沒有顯著增加（89% )。
[0115] 相反，變體Λ108hST6-Gal-I合成單唾液酸化形式G2+1SA。溫育2小時之后，獲 得46%的含量的單唾液酸化形式G2+1SA。溫育8小時之后，含量增加至70%G2+1SA(圖3)。
【主權(quán)項】
1. 一種組合物，其包含允許糖基轉(zhuǎn)移酶活性的水性緩沖液，所述組合物進(jìn)一步包含： (a) 糖基化的目標(biāo)分子，所述目標(biāo)分子選自糖蛋白和糖脂，所述目標(biāo)分子包含多個觸 角，所述觸角中的至少兩個各自具有作為末端結(jié)構(gòu)的在半乳糖基殘基中的C6位置具有羥 基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙?；?β-D-葡糖胺部分； (b) SEQIDN0:2的Ν-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(Δ89 hST6Gal-I)； (c) SEQIDNO: 3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(Δ108 hST6Gal-I)； (d) 作為唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)的供體化合物的胞苷-5' -單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨 酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述目標(biāo)分子是選自糖基化的細(xì)胞表面蛋白、糖基 化的蛋白信號傳導(dǎo)分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒來源的蛋白的糖蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項的組合物，其中Δ89hST6Gal-I和Δ108hST6Gal-I 各自以預(yù)定量存在。4. 根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中Δ89hST6Gal_I和Δ108hST6Gal_I的各自量具有 預(yù)定的酶促活性。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的組合物的用途，其用于在體外和允許糖基轉(zhuǎn)移酶酶 促活性的條件下產(chǎn)生具有添加至目標(biāo)分子的一個或多個觸角末端結(jié)構(gòu)的一個或多個唾液 酸殘基的唾液酸化目標(biāo)分子。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其為根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的組合物用于體外產(chǎn)生 具有受控量的添加至目標(biāo)分子的一個或多個觸角末端結(jié)構(gòu)的唾液酸殘基的唾液酸化目標(biāo) 分子的用途。7. 根據(jù)權(quán)利要求5和6中任一項的用途，其中Δ89hST6Gal-I催化二-唾液酸化的目 標(biāo)分子或更高唾液酸化的目標(biāo)分子的形成，且A108hST6Gal_I催化單唾液酸化的目標(biāo)分 子的形成。8. 用于體外產(chǎn)生具有受控量的添加至目標(biāo)分子的一個或多個觸角末端結(jié)構(gòu)的唾液酸 殘基的唾液酸化目標(biāo)分子的方法，所述目標(biāo)分子選自糖蛋白和糖脂，所述目標(biāo)分子包含多 個觸角，所述觸角中的至少兩個各自具有作為末端結(jié)構(gòu)的在半乳糖基殘基中的C6位置具 有羥基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙?；?β-D-葡糖胺部分，所述方法包括以下步驟： (a) 提供根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的組合物； (b) 在允許糖基轉(zhuǎn)移酶酶促活性的條件下且持續(xù)預(yù)定時間間隔溫育步驟（a)的 組合物，從而形成末端觸角N-乙酰神經(jīng)氨酰基-α2, 6-β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰 基-β-D-葡糖胺殘基，其中Λ89hST6Gal-I催化雙唾液酸化目標(biāo)分子的形成，且Λ108 hST6Gal-I催化單唾液酸化目標(biāo)分子的形成， 從而體外產(chǎn)生具有受控量的添加至目標(biāo)分子的一個或多個觸角末端結(jié)構(gòu)的唾液酸殘 基的唾液酸化目標(biāo)分子。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中所述目標(biāo)分子與Δ89hST6Gal_I和Δ108 hST6Gal-I在相同容器中和相同條件下同時溫育。10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中Δ89hST6Gal-I催化二-唾液酸化的目標(biāo)分子或更 高唾液酸化的目標(biāo)分子的形成，且A108hST6Gal-I催化單唾液酸化的目標(biāo)分子的形成。11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中A108hST6Gal_I酶促活性的量相對于Δ89hST6Gal-I酶促活性的量更高導(dǎo)致形成單唾液酸化的目標(biāo)分子的可能性與形成二-或更高 唾液酸化的目標(biāo)分子的可能性相比增加。12. 根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項的方法，其中所述目標(biāo)分子不含作為觸角末端結(jié)構(gòu) 的唾液酸殘基。13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述目標(biāo)分子是IgG類的單克隆抗體，具體地選自 IgGl、IgG2、IgG3 和IgG4。14. 糖基化的目標(biāo)分子的制備物，所述目標(biāo)分子為IgG亞類的免疫球蛋白分子，其中所 述制備物中的單和雙唾液酸化的目標(biāo)分子的量是受控量，所述制備物通過根據(jù)權(quán)利要求8 至13中任意的方法獲得。 15. SEQIDNO: 3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(β108 hST6Gal-I)的用途，其用于從目標(biāo)分子特異性形成單唾液酸化目標(biāo)分子， 其中所述目標(biāo)分子選自糖蛋白或糖脂， 其中所述目標(biāo)分子包含多個觸角目標(biāo)部分，所述觸角目標(biāo)部分具有作為末端結(jié)構(gòu)的在 半乳糖基殘基中的C6位置具有羥基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙?；?β-D-葡糖胺部分， 其中所述單-唾液酸化目標(biāo)分子包含單一唾液酸化末端觸角目標(biāo)部分，且 其中所述唾液酸化末端觸角目標(biāo)部分包含一個Ν-乙酰神經(jīng)氨?；?α2, 6-β-D-半乳 糖基-1，4-Ν-乙?；?β-D-葡糖胺殘基。16. 用于體外產(chǎn)生具有添加至目標(biāo)分子的一個觸角末端結(jié)構(gòu)的單一唾液酸殘基的唾液 酸化目標(biāo)分子的方法，所述方法包括以下步驟 (a) 提供組合物，其包含 i. 目標(biāo)分子，所述目標(biāo)分子選自糖蛋白和糖脂，所述目標(biāo)分子包含多個觸角，所述 觸角中的至少兩個各自具有作為末端結(jié)構(gòu)的在半乳糖基殘基中的C6位置具有羥基的 β-D-半乳糖基-1，4-N-乙?；?β-D-葡糖胺部分； ii.SEQIDNO: 3的Ν-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(β108hST6Gal-I)； iii. 作為唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)的供體化合物的胞苷-5'-單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨 酸； (b) 在允許糖基轉(zhuǎn)移酶酶促活性的條件下溫育步驟（a)的組合物，從而每個目標(biāo)分子 形成單一末端觸角N-乙酰神經(jīng)氨?；?α2, 6-β-D-半乳糖基-1，4-N-乙?；?β-D-葡 糖胺殘基； 從而體外產(chǎn)生具有添加至所述目標(biāo)分子的一個觸角末端結(jié)構(gòu)的單一唾液酸殘基的唾 液酸化目標(biāo)分子。17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中步驟（a)中提供的目標(biāo)分子無α2,6唾液酸化末端 觸角殘基。18. 選自糖蛋白和糖脂的單-唾液酸化目標(biāo)分子，所述單-唾液酸化目標(biāo)分子可通過根 據(jù)權(quán)利要求17的方法獲得。
【專利摘要】本公開涉及具有N-末端截短缺失的某些糖基轉(zhuǎn)移酶變體的用途。發(fā)現(xiàn)人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(hST6Gal-I)的兩種不同的截短變體的組合表現(xiàn)出不同的唾液酸轉(zhuǎn)移酶比活性。在一個例子中，在其中第一變體?89？hST6Gal-I催化雙唾液酸化目標(biāo)分子的形成的條件下，第二變體?108？hST6Gal-I催化單唾液酸化目標(biāo)分子的形成。因此，公開了哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶的變體，編碼其的核酸，用于重組產(chǎn)生哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶的變體的方法和方式及其用途，特別是用于以定量受控方式唾液酸化作為糖蛋白諸如免疫球蛋白的部分的聚糖部分的末端受體基團(tuán)的用途。
【IPC分類】C07K16/00, C12P19/18, C12N9/10, C12P21/00
【公開號】CN105358703
【申請?zhí)枴緾N201480038103
【發(fā)明人】T.察巴尼, A.恩格爾, M.格里夫, C.容, C.盧利, S.馬利克, R.米勒, B.尼德茨基, D.里比奇, K.施默爾策, H.施瓦布, H.佐貝克, B.蘇普曼, M.托曼, S.齊岑巴赫爾
【申請人】豪夫邁·羅氏有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2014年7月3日
【公告號】CA2911965A1, EP3017057A1, US20160102333, WO2015001033A1