通過紅豆杉植物細胞系三線技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉烷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用小分子次級代謝產(chǎn)物的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用G-M-P三線技術(shù)，通過紅豆杉細胞規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇、10DAB和云南紫杉烷Tc的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紫杉醇(Paclitaxel，CAS N0.: 33069-62-4，早期和商品名為Taxol)是從紅豆杉屬植物(Taxus.L)的樹皮和枝葉中分離出來的對卵巢癌和乳腺癌有特殊療效的抗腫瘤藥物。有限的紅豆杉屬植物資源使得紫杉醇成為一種比較昂貴的藥物，并影響到它在臨床上長期、廣泛的應(yīng)用。多年來，人們一直在致力于尋找解決紫杉醇藥源的新途徑。
[0003]紫杉醇化學(xué)全合成雖然早已成功，但合成路線長，產(chǎn)率低，成本高，不能商業(yè)化生產(chǎn)。半合成是目前臨床應(yīng)用紫杉醇的主要來源，半合成的前體為由紅豆杉枝葉中分離得到的 Baccatin III (巴卡亭 III，本專利中簡寫為 BAT III，CAS N0.: 27548-93-2)或10-Deacetylbaccatin III(10 一去乙醜基巴卡亭 III，本專利中簡寫為 10DAB，CAS N0.:32981-86-5，極少用92999_93_4)等，但依然遠遠滿足不了臨床及實驗的需要。紅豆杉屬植物的組織與細胞培養(yǎng)，生產(chǎn)紫杉醇，以及生產(chǎn)重要中間體10DAB，BAT III等被認為是一種有潛力的方法之一而受到人們的重視。
[0004]在努力拓展紫杉醇的藥源并提高紫杉醇產(chǎn)量的同時，科學(xué)家亦投身到紫杉烷類化合物的研究中，期望找到抗癌活性更好的紫杉烷類化合物或者找到合適的先導(dǎo)化合物。已經(jīng)有幾百種紫杉烷從紫杉原植物或細胞培養(yǎng)液中分離出來。其中云南紫杉烷Tc(Taxuyunnanine C，不是Taxol C)是一種具有類神經(jīng)生長因子(NGF)活性的化合物，能夠強化NGF的作用，有利于老年癡呆癥(Alzheimer’s disease)的治療。Tc與紫杉醇同屬于三環(huán)二萜類化合物。
[0005]紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其中間體的工藝體系中，見圖1，目前普遍使用兩線(細胞生長G-次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)P兩階段)培養(yǎng)技術(shù)體系，見圖2。在此體系下，高產(chǎn)下的穩(wěn)產(chǎn)非常困難。主要原因在于次級代謝與初級代謝非常不同，次級代謝產(chǎn)物不是植物細胞生長所必須的，所以要經(jīng)過誘導(dǎo)、刺激，感受環(huán)境的壓力后，才能產(chǎn)生，而且其產(chǎn)生和產(chǎn)量都受到多級的調(diào)控，包括短期的正反饋和長期的負反饋，生產(chǎn)具有極大的不確定性。尤其是植物細胞的長期繼代中，由于對環(huán)境的不斷適應(yīng)，基因組雖然變化不大，但表觀遺傳越來越不利于次級代謝的生產(chǎn)。對于工業(yè)化，植物細胞的繼代生長和次級代謝產(chǎn)物的調(diào)控生產(chǎn)有不同的工藝要求，比如，繼代生長要求細胞的生物量越大越好，與初級代謝無關(guān)的基因最好都是關(guān)閉的、沉沒的，染色體區(qū)域被異染色質(zhì)化，涉及組蛋白甲基化、去乙?；?、乙酰化，DNA的甲基化修飾，甲基化修飾組蛋白結(jié)合蛋白Sir2/3/4，甲基化DNA結(jié)合蛋白，非編碼RNA等等在內(nèi)的一系列復(fù)雜組分的生理反應(yīng)過程?；虺良艑?dǎo)致相應(yīng)區(qū)段內(nèi)的遺傳信息不能被轉(zhuǎn)錄。而次級代謝產(chǎn)物的調(diào)控生產(chǎn)，卻要求在主動刺激植物細胞后，植物細胞的次級代謝基因組能迅速開放，而初級代謝的基因組最好得到抑制，但又不能引起細胞的過度的凋亡和死亡。大部分的次級代謝產(chǎn)物，對于植物宿主細胞來說，是加重了代謝流的負擔(dān)，而且許多次級代謝產(chǎn)物對于宿主細胞本身也有毒性。比如，紫杉醇，就是通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩(wěn)定，抑制細胞有絲分裂。這對同屬于真核生物的紅豆杉植物細胞來說也是具有毒性的，抑制紅豆杉植物細胞的分裂，引起細胞凋亡。因此，植物細胞的兩個階段的代謝流控制是非常對立的，轉(zhuǎn)化階段控制不好，很容易產(chǎn)生兩個效果:一是調(diào)控誘導(dǎo)無效，植物細胞繼續(xù)大量擴增，次級代謝產(chǎn)物極低從而沒有商業(yè)生產(chǎn)價值，收獲的是外觀極佳的細胞團；二是調(diào)控過頭，植物細胞大量變紅、褐化、死亡，次級代謝剛開始，細胞就死亡了，收獲的是沒有高產(chǎn)量的紅褐色的培養(yǎng)液。因此，兩線技術(shù)非常難以滿足有用次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點與不足，本發(fā)明公開了一種采用三線技術(shù)通過紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉烷的方法，其特征在于按如下的步驟進行:
(1)構(gòu)建南方紅豆杉細胞系的繼代線，簡稱為G線，接種的細胞鮮重為100g/L，接種100%新鮮膜過濾的B5培養(yǎng)基，繼代生長周期為14天，在500mL搖瓶階段，新鮮B5的裝液量為20% ;在反應(yīng)器中全培養(yǎng)液的裝液量為10~20% 個周期中細胞鮮重的倍增為2~4倍，在搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100~120rpm，或在反應(yīng)器上振蕩頻率為12~16rpm，避光培養(yǎng)；所述的B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基指的是:生長素為2，4-D，含量10mg/L，分裂素為6-BA，含量為lmg/L，蔗糖濃度為15g/L ；
(2)構(gòu)建紅豆杉細胞系的一條過渡線，簡稱Μ線，其方法是，Μ線第1代種子來源于G線，其后代的種子都是來源于上一代的Μ線，一直持續(xù)到2~7代，接種的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Β5，但只加50%的磷酸鹽，即使用濃度0.85g/L ;另外還添加了谷氨酰胺GLN 2mg/L，調(diào)整蔗糖濃度為25g/L，并進行磷酸鹽饑餓法進行細胞周期同步化培養(yǎng)，每代Ml線的細胞進行固定調(diào)控策略，甲基茉莉酸100 μ M、硫代硫酸銀10mM的跟蹤，其磷酸鹽饑餓法的步驟:在每代次的第7天、第10天和點12天分別加入20%、20%和10%的磷酸鹽，在搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100~120rpm,或在反應(yīng)器上振蕩頻率為12~16rpm，避光培養(yǎng)；所述的植物激素指的是，最終使用濃度的生長素為NAA 40mg/L，分裂素6_BA 2mg/L ;
(3)構(gòu)建紅豆杉細胞系的一條生產(chǎn)線，簡稱P線，其方法是，Μ線的紅豆杉植物細胞團作為Ρ線的種子，每個Μ代次的反應(yīng)器都對應(yīng)一個Ρ線上的一個反應(yīng)器，Ρ線上的反應(yīng)器都是使用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)整植物激素配比和含量，最終使用濃度，生長素為NAA 10~30mg/L,分裂素為6-BA l~10mg/L ;調(diào)整蔗糖濃度為25~60 g/L，接種時，MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基占50%的體積，原Μ線上培養(yǎng)14天的條件培養(yǎng)基及培養(yǎng)物占50%體積。接種的生物量為160~300g/L，在搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100~120rpm，或在反應(yīng)器上振蕩頻率為12~16rpm，避光培養(yǎng)；在培養(yǎng)第0-10天加入茉莉酸甲酯50-300 μ M，在第5~30天加入XAD-7性大孔樹脂5_200g/L，在第7、11、15和21天進行補料培養(yǎng)，所補料液由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基的大量元素和茉莉酸甲酯l~100mM組成，從第10天開始補料，一直補料到第30天，補料的速率是每天補加培養(yǎng)起始體積的0.5%。第30天可以收獲，進行紫杉烷的分離和純化。
[0007]本發(fā)明所用的種子系為高產(chǎn)紫杉醇的南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10002，高產(chǎn)10DAB的南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10001，高產(chǎn)云南紫杉烷Tc的南方紅豆杉細胞系TA-2。
[0008]本發(fā)明進一步公開了采用三線技術(shù)通過紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉烷方法在制備提高生產(chǎn)紫杉醇批次穩(wěn)定性方面的應(yīng)用。所使用的容器，包括一般性的搖瓶，也包括特指的反應(yīng)器，尤其特指中國專利的一次性反應(yīng)器(ZL 201210021722.6)。提高生產(chǎn)紫杉醇批次穩(wěn)定性指的是:紫杉醇高產(chǎn)在100mg/L以上批次，穩(wěn)定性上升到74% ;10DAB高產(chǎn)超過200mg/L以上批次超過70% ;云南紫杉烷lg/L以上的批次超過90% (成功批次/總批次)。
[0009]本專利通過紅豆杉植物細胞系規(guī)模培養(yǎng)兩線體系G-Ρ (常稱之為兩階段培養(yǎng))中，插入中間階段的細胞線M，進行有序、平穩(wěn)過渡，能兼顧細胞繼代生長和次級代謝產(chǎn)物的調(diào)控生產(chǎn)兩個階段的不同工藝要求。本發(fā)明與現(xiàn)有方案所不同的關(guān)鍵點在于: