50mg/L以下，并伴隨著褐化和衰退。對原G-Ρ結構進行了更新，采用G-M-P三線技術，在南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10002的繼代線P2之后，先建立一條過渡線M2，采用添加激素6-BA 2mg/L，GLN 2mg/L，調整蔗糖濃度為25g/L，并進行磷酸鹽饑餓等方法進行細胞周期同步化培養(yǎng)，每代M2線的細胞一半進入調控生產線P2線，進行各種調控策略(甲基茉莉酸100 μ Μ、硫代硫酸銀10mM，保持蔗糖濃度15~30g/L，保持蔗糖濃度15~30g/L，并配合添加XAD-7大孔樹脂5~200g/L))的跟蹤，發(fā)現第20-70代G2線，經過M2線調整，所獲得調控P2線第1~5代紫杉醇恢復了高產。
[0021]此G-M-P三線技術進一步在艾賽博公司專利反應器平臺上進行了驗證，紫杉醇的100mg/L以上的高產穩(wěn)產性，從原來的20%批次提高到74%批次。
[0022]實施例3
基本工藝參照實施例1。南方紅豆杉細胞系TA-2在搖瓶代次已經高達50~200代，繼代生長基本穩(wěn)定，G3線正常的繼代，使用B5培養(yǎng)基，每個代次的繼代鮮重倍增可以達到3~6倍，但基本不產紫杉醇和10DAB，原G-Ρ生產云南紫杉烷Tc達到50~458mg/L ;對原G-Ρ結構進行了更新，采用G-M-P三線技術，在南方紅豆杉細胞系TA-2的繼代線G3線之后，先建立一條過渡線M3線，采用添加激素6-BA 2mg/L，GLN 2mg/L，調整蔗糖濃度為25g/L，并進行磷酸鹽饑餓等方法進行細胞周期同步化培養(yǎng)，每代M3線的細胞之后有一部分細胞進入生產型P3期，進行各種調控策略(甲基茉莉酸100 μ Μ、硫代硫酸銀10mM，保持蔗糖濃度15~30g/L，并配合添加XAD-7大孔樹脂5~200g/L)的跟蹤，發(fā)現第50~200代紅豆杉細胞系TA-2株的G3線，經過M3線調整，所獲得調控P3線第1~5代產量能夠更高產云南紫杉烷Tc可達150~1800mg/Lo云南紫杉烷lg/L以上的批次超過90%。
[0023]參考文獻:
[1]BRINGI, Venkataraman (美國)等，提高紅豆杉細胞培養(yǎng)中紫杉醇和紫杉烷產量的方法，國際專利，W0 97/44476.[2]Homare Tabata (日本)，Paclitaxel Product1n by Plant-Cel1-CultureTechnology, Adv B1chem Engin/B1technol (2004) 7: 1 - 23.[3]張衛(wèi)、魏先宇，帶有曝氣裝置的一次性波浪式生物反應器，中國專利ZL201210021722.6。
[0024][4]王麗等，具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株及其應用，中國專利201410726274.9。
[0025][5]張衛(wèi)等，具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株及其應用，中國專利201410726199.6
[6]張衛(wèi)(ZHANG WEI)等，一種用于生物反應器的搖動平臺(實用新型)，中國專利201410675127.3。
[0026][7]張衛(wèi)(ZHANG WEI)等，一種用于生物反應器的搖動平臺，中國專利201420705851.1
[8]崔亨均(韓國)等，通過半連續(xù)培養(yǎng)大量生產紫杉醇的方法，中國專利96190419.4及 CN1153533。
【主權項】
1.一種采用三線技術通過紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產紫杉烷的方法，其特征在于按如下的步驟進tx: (1)構建南方紅豆杉細胞系的繼代線，簡稱為G線，接種的細胞鮮重為100g/L，接種100%新鮮的膜過濾B5培養(yǎng)基，繼代生長周期為14天，在500mL搖瓶階段，新鮮B5的裝液量為20% ;在反應器中全培養(yǎng)液的裝液量為10~20% 個周期中細胞鮮重的倍增為2~4倍，在搖瓶培養(yǎng)轉速為100~120rpm，或在反應器上振蕩頻率為12~16rpm，避光培養(yǎng)；所述的B5基礎培養(yǎng)基指的是:生長素為2，4-D，含量10mg/L，分裂素為6-BA，含量為lmg/L，蔗糖濃度為15g/L ； (2)構建紅豆杉細胞系的一條過渡線，簡稱Μ線，其方法是，Μ線第1代種子來源于G線的一個代次，其后代的種子都是來源于上一代的Μ線，一直持續(xù)到2~7代，接種的新鮮基礎培養(yǎng)基為Β5，但只加50%的磷酸鹽，使用濃度0.85g/L，另調整植物激素配比和含量；另外還添加了谷氨酰胺GLN 2mg/L，調整蔗糖濃度為25g/L，并進行磷酸鹽饑餓法進行細胞周期同步化培養(yǎng)，每代Ml線的細胞進行固定調控策略，甲基茉莉酸100 μ M、硫代硫酸銀10mM的跟蹤，其磷酸鹽饑餓法的步驟:在每代次的第7天、第10天和點12天分別加入20%、20%和10%的磷酸鹽，在搖瓶培養(yǎng)轉速為100~120rpm，或在反應器上振蕩頻率為12~16rpm，避光培養(yǎng)；所述的植物激素指的是生長素為NAA 40mg/L，分裂素6_BA 2mg/L ； (3)構建紅豆杉細胞系的一條生產線，簡稱P線，其方法是，Μ線的紅豆杉植物細胞團作為Ρ線的種子，每個Μ代次的反應器都對應一個Ρ線上的一個反應器，Ρ線上的反應器都是使用MS基礎培養(yǎng)基，調整植物激素配比和含量，最終使用濃度，生長素為NAA 10~30mg/L,分裂素為6-BA l~10mg/L ;調整蔗糖濃度為25~60 g/L，接種時，MS基礎培養(yǎng)基占50%的體積，原Μ線上培養(yǎng)14天的條件培養(yǎng)基及培養(yǎng)物占50%體積； 接種的生物量為160~300g/L，在搖瓶培養(yǎng)轉速為100~120rpm，或在反應器上振蕩頻率為12~16rpm，避光培養(yǎng)；在培養(yǎng)第0~10天加入茉莉酸甲酯50-300 μ M，在第5~30天加入XAD-7性大孔樹脂5-200g/L，在第7、11、15和21天進行補料培養(yǎng)，所補料液由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基礎培養(yǎng)基的大量元素和茉莉酸甲酯l~100mM組成，從第10天開始補料，一直補料到第30天，補料的速率是每天補加培養(yǎng)起始體積的0.5% ; 第30天可以收獲，進行紫杉烷的分離和純化。2.一種采用三線技術通過紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產紫杉烷的方法，其特征在于所用的種子系為高產紫杉醇的南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10002，高產10DAB的南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10001，高產云南紫杉烷Tc的南方紅豆杉細胞系TA-2。3.權利要求1所述采用三線技術通過紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產紫杉烷方法在制備提高生產紫杉醇批次穩(wěn)定性方面的應用。4.權利要求1所述采用三線技術通過紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產紫杉烷方法所使用的容器，包括一般性的搖瓶，也包括特指的反應器，尤其特指一次性反應器。5.權利要求3所述的應用，其中提高生產紫杉醇批次穩(wěn)定性指的是:紫杉醇高產在100mg/L以上批次，穩(wěn)定性上升到74% ；10DAB高產超過200mg/L以上批次超過70% ;云南紫杉烷lg/L以上的批次超過90%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過紅豆杉植物細胞系三線技術大規(guī)模培養(yǎng)生產紫杉烷的方法。主要是通過紅豆杉植物細胞系規(guī)模培養(yǎng)兩線體系G-P中，插入中間階段的細胞線M，進行有序、平穩(wěn)過渡，能兼顧細胞繼代生長和次級代謝產物的調控生產兩個階段的不同工藝要求。本發(fā)明與現有方案所不同的關鍵點在于：在植物細胞繼代線G之后，不是立刻進行調控誘導生產，而是先進行細胞狀態(tài)調整，包括培養(yǎng)基組分的部分改變、抗褐變劑的添加，激素比例改變來調整細胞團的大小和致密度，并控制細胞周期，通過這個短期過渡線M，再轉入終端的調控生產線P。最終獲得了高產和穩(wěn)產的兼顧。
【IPC分類】C12P15/00, C12R1/91
【公開號】CN105368888
【申請?zhí)枴緾N201510840058
【發(fā)明人】丁靖志, 王海燕, 張衛(wèi)
【申請人】天津艾賽博生物技術有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月27日