在植物細胞繼代線G之后，不是立刻進行調(diào)控誘導生產(chǎn)，而是先進行細胞狀態(tài)調(diào)整，包括培養(yǎng)基組分的部分改變、抗褐變劑的添加，激素比例改變來調(diào)整細胞團的大小和致密度，并控制細胞周期，通過這個短期過渡線M，再轉(zhuǎn)入終端的調(diào)控生產(chǎn)線P。最終獲得了高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的兼顧。
[0010]所謂培養(yǎng)基組分的改變，包括大量元素的調(diào)整，尤其是其中的磷酸鹽。逐步減少和控制磷酸鹽，來誘導細胞周期進行減速，而且同步化?？购肿儎?，一般是包括:維生素VC、谷氨酰胺GLN、活性炭AC、半胱氨酸Cys、脫落酸ABA、檸檬酸、硫代硫酸鈉、硝酸銀、水解酪蛋白LH、聚乙烯吡咯烷酮PVP、植酸PA、桂皮酸、萘甲酸、2-氨基茚-2-膦酸AIP、褪黑素和谷胱甘肽等。0.1%AC、0.6g/L水解乳蛋白LH和0.01%植酸PA具有的顯著抗褐化作用。1mM AIP的抗褐化效果也及其顯著。激素比例改變，對植物細胞的生長和調(diào)控都具有極大的作用。在細胞繼代的G線，我們常常使用長效的植物生長素，比如使用(2，4-二氯苯氧基)乙酸即2，4-D,含量2.0-40 mg/L，搭配的植物分裂素是6-芐氨基腺嘌呤即6-BA，含量為0.5-10 mg/L。在類似這樣的激素配比下，植物細胞團一般逐漸變得疏松，細胞團的大小走向一致，一般直徑在0.1~10_，而顏色越來越淺，細胞內(nèi)和細胞團的含水量越來越增加，達到90~98%，而生長越來越快，一般能達到一個周期3~8倍。所以在Μ線階段，另改植物激素配比和含量，最終使用濃度，生長素為短效的NAA 10~40mg/L,分裂素6-BA提高濃度，達到2-20 mg/L;另外還添加了谷氨酰胺GLN 1-10 mg/L，調(diào)整蔗糖濃度為20~40 g/L。在Μ線階段，細胞的生長速度變得稍微減速，減到每個細胞周期鮮重增加2.5-3.5倍；細胞團變小些，達到0.1-5 mm，而含水量逐步減少到85~95%。這時候，許多植物細胞的次級代謝的基因逐步打開，為高產(chǎn)的P線階段做好充分的準備。
[0011]在生產(chǎn)的P階段，都是使用MS基礎培養(yǎng)基，這里大量元素的比例和原來的G-Μ階段的B5基礎培養(yǎng)基的比例有所不同。其中植物激素配比和含量，最終使用濃度是生長素為NAA 10~30mg/L，分裂素為6-BA l~10mg/L ;調(diào)整蔗糖濃度為25~60 g/L。接種時，MS基礎培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基及培養(yǎng)物各占一定體積比例，為了植物細胞能順利地進行過度。加大接種的生物量為160~300g/L，在搖瓶上轉(zhuǎn)速增加些，使得混合得更加充分。在培養(yǎng)階段加入調(diào)控誘導劑，比如茉莉酸甲酯50~300 μΜ、硝酸銀l~20mM、硫代硫酸銀l~100mM、冠菌素1~100 μΜ等。并加入XAD系列或者其他類型的大孔樹脂5-200g/L，或者環(huán)糊精⑶各型，進行兩相培養(yǎng)。培養(yǎng)的全過程中監(jiān)控營養(yǎng)消耗，并進行補料，所補料液，有各種各樣的組成，比如phyton專利中的F1~F3，或者我們實施例1中所舉的例子，由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基礎培養(yǎng)基的大量元素和茉莉酸甲酯1-100 μ Μ組成。一般，在加調(diào)控劑的第6~80天都可以收獲，進行紫杉烷、10DAB和云南紫杉烷Tc的分離和純化。
[0012]本發(fā)明公開的采用三線技術通過紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉烷的方法與現(xiàn)有方案所不同的關鍵點在于:
在植物細胞繼代線G和終端的調(diào)控生產(chǎn)線P，中間插入中間線M，為G-M-P結構。原來只有G-Ρ結構。GMP通過資源配置，以增加1條種子線的代價，提高了生產(chǎn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
[0013]常規(guī)的兩線技術路線，見圖2，生產(chǎn)的紫杉醇高產(chǎn)在100mg/L以上，只有20%頻率的成功批次；高產(chǎn)紫杉醇、10DAB和云南紫杉烷Tc的三種細胞系與三種不同的懸浮繼代培養(yǎng)基、中間過渡培養(yǎng)方法和調(diào)控生產(chǎn)培養(yǎng)基的組合，包括特定的一次性反應器體系(指的是中國專利 201420705851.1,201410675127.3 和 ZL 201210021722.6)，整個三線生產(chǎn)體系的構建方法和生產(chǎn)線結構，見圖3。
[0014]MS培養(yǎng)基是1962年穆拉希吉克(Murashige，T.)和斯科克(Skoog，F(xiàn).)為培養(yǎng)菸草材料而設計的，它對在固體培養(yǎng)條件下誘導愈傷組織，在液體培養(yǎng)條件下作細胞懸浮培養(yǎng)及用于胚、莖尖、莖段及花藥等的培養(yǎng)和形態(tài)發(fā)生研究方面，均獲得了明顯的成功。MS培養(yǎng)基中無機養(yǎng)份的數(shù)量和比例均較合適，足以滿足很多植物細胞在營養(yǎng)和生理上的需要。
[0015]B5培養(yǎng)基是甘博格(Gamborg)等1968年設計的，它的主要特點是含有較低的銨，而銨這一營養(yǎng)成分可能對有些培養(yǎng)基有抑制生長的作用。當在傷組織和懸浮培養(yǎng)中對B5培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基進行對比培養(yǎng)試驗時，發(fā)現(xiàn)有些植物的愈傷組織和細胞培養(yǎng)物在MS培養(yǎng)基上生長得好，有些在B5培養(yǎng)基上生長得更適宜。
[0016]MS和B5都是植物細胞培養(yǎng)常見的培養(yǎng)基配方，本發(fā)明中所用的基本培養(yǎng)基，都是包括MS和B5標準配方中的大量元素、微量元素、有機物以及pH控制，但對植物激素、蔗糖含量和其他添加物有不同的規(guī)定，具體見各實施例。
[0017]【附圖說明】:
圖1、植物細胞建立到生產(chǎn)的技術路線圖圖2、紅豆杉植物細胞兩階段G-ρ兩線技術路線圖圖3、紅豆杉植物細胞G-M-P兩線技術路線圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用到的試劑出特別說明外均有市售，南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10001、南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10002是指發(fā)明人專利細胞株；植物細胞培養(yǎng)中常用的B5和MS培養(yǎng)基基礎配方也見常規(guī)文獻，試劑也是常規(guī)AR級或其他適用級另IJ。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件進行。
[0019]實施例1
南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10001 (中國專利201410726274.9)在細胞早代次時能高產(chǎn)10DAB，可達到388mg/L ;但當細胞在中代次時候，10DAB的產(chǎn)量下降到100~200mg/L ；30代次之后，10DAB的產(chǎn)量下降到50mg/L以下，并伴隨著褐化和衰退。對原G-Ρ結構進行了更新，采用G-M-P三線技術，在南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10001的繼代線G1之后，先建立一條過渡線M1，采用添加激素6-BA 2mg/L，GLN 2mg/L，調(diào)整蔗糖濃度為25g/L，并進行磷酸鹽饑餓等方法進行細胞周期同步化培養(yǎng)，每代Ml線的細胞有一半進入調(diào)控繼代P1線，進行固定調(diào)控策略:P線上的反應器都是使用MS基礎培養(yǎng)基，調(diào)整植物激素配比和含量，最終使用濃度，生長素為NAA 10mg/L，分裂素為6-BA 2mg/L ;調(diào)整蔗糖濃度為45 g/L。接種時，MS基礎培養(yǎng)基占50%的體積，原Μ線上培養(yǎng)14天的條件培養(yǎng)基及培養(yǎng)物占50%體積。接種的生物量為200g/L，在搖瓶上轉(zhuǎn)速為llOrpm，或在反應器上振蕩頻率為16rpm，避光培養(yǎng)。在培養(yǎng)第0~10天加入茉莉酸甲酯100 μ M。在第5天和第10天加入XAD-7大孔樹脂各50g/Lo在第7、11、15和21天進行補料培養(yǎng)，所補料液由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基礎培養(yǎng)基的大量元素和茉莉酸甲酯50mM組成，從第10天開始補料，一直補料到第30天，補料的速率是每天補加培養(yǎng)起始體積的0.5%。第30天可以收獲，進行紫杉烷的分離和純化。發(fā)現(xiàn)第20-30代G線，經(jīng)過Ml線調(diào)整，所獲得調(diào)控P1線的第1~3代10DAB的產(chǎn)量得到了恢復。
[0020]實施例2
基本工藝參照實施例1。南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10002 (中國專利201410726199.6)在細胞早代次，早1~10代次時能高產(chǎn)紫杉醇，可達到50~358mg/L ;但細胞在中代次時候，紫杉醇的產(chǎn)量下降到20~200mg/L ;30代次之后，紫杉醇的產(chǎn)量下降到0~1