一種香蕉枯萎病復合病原菌及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)植物保護技術領域，具體涉及一種香蕉枯萎病復合病原菌及其制 備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 香蕉枯萎病是一種毀滅性病害，其病原菌為古巴尖孢鐮刀菌，其中以4號和1號生 理小種對香蕉的危害最嚴重。該病為土傳病害，病原菌從香蕉根部侵入后，通過維管組織從 下部向上部傳導，并在根、球莖和假莖中定殖，因而藥劑防治的效果較差，選育抗病品種被 認為是防治該病最有效的措施。
[0003] 抗病品種的大田鑒定和篩選是香蕉枯萎病抗病品種選育的關鍵。目前，抗病品種 大田鑒定和篩選的方法主要有兩種，一種是直接種植在發(fā)病的田塊進行抗病性鑒定，另一 種是種植后大田接種單一的病原菌，這兩種方法都存在病原菌單一、分布不均勻、發(fā)病慢、 鑒定周期長、篩選結(jié)果不準確等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種香蕉枯萎病復合病原菌。
[0005] 本發(fā)明的目的之二是提供了所述香蕉枯萎病復合病原菌的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的目的之三是提供了所述香蕉枯萎病復合病原菌的應用。
[0007] 本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：
[0008] -種香蕉枯萎病復合病原菌，由液體病原菌菌液和固體病原菌菌塊組成，每IL所 述液體病原菌菌液中混合80~120g所述固體病原菌菌塊。
[0009] 其中，所述液體病原菌菌液由香蕉枯萎病菌塊接種于馬鈴薯-乳糖培養(yǎng)液中制 得；所述固體病原菌菌塊由香蕉枯萎病病原菌母液接種至麥粒培養(yǎng)基中制得。
[0010] 其中，所述液體病原菌菌液為濃度為106cfu/mL的香蕉枯萎病4號生理小種病原 菌菌液和1號生理小種病原菌菌液混合物，所述香蕉枯萎病4號生理小種病原菌菌液和1 號生理小種病原菌菌液之間的體積比3~5 : 1。
[0011] 其中，所述固體病原菌菌塊為香蕉枯萎病4號生理小種固體病原菌菌塊和1號生 理小種固體病原菌菌塊的混合物，所述香蕉枯萎病4號生理小種固體病原菌菌塊和1號生 理小種固體病原菌菌塊之間的重量比3~5 : 1。
[0012] 所述香蕉枯萎病復合病原菌的制備方法，具體為：
[0013] (1)病原菌母液的培養(yǎng)：將香蕉枯萎病4號生理小種和1號生理小種菌塊分別接 種于馬鈴薯-乳糖培養(yǎng)液中，22°C~28°C下培養(yǎng)5~7天后，分別制得香蕉枯萎病4號生理 小種的病原菌母液和香蕉枯萎病1號生理小種的病原菌母液；
[0014] (2)液體病原菌菌液制備：
[0015] A.將香蕉枯萎病4號生理小種和1號生理小種的病原菌母液分別接種到初級馬鈴 薯-乳糖培養(yǎng)液中，22°C~28°C下培養(yǎng)6~8天，得到香蕉枯萎病4號生理小種和1號生理 小種的初級培養(yǎng)物；
[0016] B.接著將初級培養(yǎng)物接種到次級馬鈴薯-乳糖培養(yǎng)液中，22°C~28°C下培養(yǎng)7~ 9天至菌液濃度為108cfu/mL，分別得到香蕉枯萎病4號生理小種和1號生理小種病原菌菌 液；
[0017] C.分別將所述香蕉枯萎病4號生理小種和1號生理小種病原菌菌液，稀釋至 106cfu/mL，再將稀釋后的兩者菌液按體積比3~5 : 1的比例混合均勾，得到所述液體病 原菌菌液；
[0018] (3)固體病原菌菌塊制備：香蕉枯萎病4號生理小種和1號生理小種的病原菌母 液分別接種至麥粒培養(yǎng)基中，22°C~28°C下培養(yǎng)8~12天，分別香蕉枯萎病4號生理小種 和1號生理小種的固體菌塊，將香蕉枯萎病4號生理小種和1號生理小種的固體菌塊按重 量比3~5 : 1的比例混合均勻，得到所述固體病原菌菌塊；
[0019] (4)復合病原菌的制備：按IL液體病原菌菌液加入80~120g固體病原菌菌塊的 量，將所述固體病原菌菌塊搗碎在所述液體病原菌菌液中，混合均勻即得所述香蕉枯萎病 復合病原菌。
[0020] 較佳地，所述的馬鈴薯乳糖培養(yǎng)液通過以下方法制得：稱取去皮馬鈴薯塊100~ 300g，加水800~1200ml煮沸15~25min至馬鈴薯塊能被玻璃棒搗碎為止，用雙層紗布過 濾取汁，加水至1000 ml，稱取15~25g乳糖加入馬鈴薯過濾夜中，攪拌均勻，裝入三角瓶中， 放入高壓滅菌鍋內(nèi)在121°C ±2°C和98kpa±0. 2kpa下高溫滅菌15~25min ;制得所述馬 鈴薯-乳糖培養(yǎng)液。
[0021] 較佳地，所述的麥粒培養(yǎng)基通過以下方法制得：將麥粒用水浸泡4~6h，瀝干， 取70~80g麥粒，裝入體積為100~150ml的培養(yǎng)瓶中，蓋好瓶蓋，放入高壓滅菌鍋內(nèi)在 121°C ±2°C和98kpa±0. 2kpa下高溫滅菌15~25min ;制得所述麥粒培養(yǎng)基。
[0022] -種香蕉枯萎病抗病品種選育中的應用，使用了所述的香蕉枯萎病復合病原菌。
[0023] -種香蕉種苗和植株接種方法，具體為：
[0024] 首先，在香蕉枯萎病病區(qū)選擇田塊作為試驗基地；
[0025] 其次，選擇7~8片生長健壯的二級試管苗作為試驗種苗，用鋒利小刀在育苗杯內(nèi) 插2~3刀，深度約8cm左右，進行傷根處理，
[0026] 再將試管苗浸泡到裝有所述的香蕉枯萎病復合病原菌的盆中，浸泡時間約5min ; 再次，將傷根浸泡接種后的香蕉種苗種植于試驗基地，種植后24h左右再淋足定根水；
[0027] 另外，在香蕉種苗種植后15天、45天、90天分別挖穴淋菌接種一次所述的香蕉枯 萎病復合病原菌。
[0028] 本發(fā)明通過配制香蕉枯萎病復合病原菌、種植前種苗傷根浸泡接種、種植后植株 挖穴淋菌接種等措施，縮短了香蕉枯萎病抗（耐）病品種鑒定周期，提高了大田鑒定篩選的 準確性，為香蕉枯萎病抗（耐）病品種的選育提供技術參考。通過配制香蕉枯萎病復合病 原菌接種液并對香蕉種苗和植株進行接種，可以比較準確的鑒定不同香蕉品種的抗病性， 同時縮短香蕉品種抗病性鑒定的時間，從而篩選出抗（耐）香蕉枯萎病品種。 具體的實施方式
[0029] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以助于本領域技術人員理 解本發(fā)明。
[0030] 實施例1
[0031] 香蕉枯萎病復合病原菌的制備：
[0032] 1)培養(yǎng)基配制
[0033] 馬鈴薯-乳糖培養(yǎng)液：稱取去皮馬鈴薯塊200g，加水1000 ml煮沸20min左右至 馬鈴薯塊能被玻璃棒搗碎為止，用雙層紗布過濾取汁，加水至1000ml，稱取20g乳糖加入馬 鈴薯過濾夜中，攪拌均勻，裝入三角瓶中，放入高壓滅菌鍋內(nèi)在121°C和98kpa下高溫滅菌 20min〇
[0034] 麥粒培養(yǎng)基：將適量麥粒用水浸泡5h，撈起后將水瀝干，然后取約75g麥粒，裝 入體積為120ml的培養(yǎng)瓶中，蓋好瓶蓋，放入高壓滅菌鍋內(nèi)在121°C和98kpa下高溫滅菌 20min〇
[0035] 2)病原菌母液的培養(yǎng)
[0036] 將香蕉枯萎病4號生理小種和1號生理小種菌塊分別接種于滅菌后的馬鈴薯-乳 糖培養(yǎng)液中，每300ml培養(yǎng)液接入3塊直徑約I. 5cm的菌餅，在溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為150r/ min搖床上振蕩培養(yǎng)6天后，備用。
[0037] 3)液體病原菌菌液制備
[0038] 首先，培養(yǎng)病原菌菌液。配制7L和70L馬鈴薯一乳糖培養(yǎng)液，分別裝入10L-100L 微生物發(fā)酵設備的IOL和100L發(fā)酵罐中，然后在121°C下高溫滅菌30min。待培養(yǎng)液冷卻 后，向IOL小發(fā)酵罐中接種500ml病原菌母液，25°C培養(yǎng)7天后，將小發(fā)酵罐中的菌液抽到 100L大發(fā)酵罐中進行接種，25°C培養(yǎng)8天，當菌液的濃度達到10 scfU/mL后，將菌液從發(fā)酵 罐抽出放到25L塑料壺中備用。按照以上培養(yǎng)方法，分別培養(yǎng)香蕉枯萎病4號生理小種和 1號生理小種病原菌菌液。
[0039] 其次，制備液體病原菌菌液。將經(jīng)10L-100L微生物發(fā)酵設備培養(yǎng)的香蕉枯萎病4 號生理小種和1號生理小種菌液分別稀釋到10 6cfu/mL濃度，然后將稀釋后的兩者菌液按 體積比4 : 1的比例混合均勻，得到液體病原菌菌液。
[0040] 4)固體病原菌菌塊制備
[0041] 首先，培養(yǎng)病原菌菌塊。用消毒過的移液搶取3ml香蕉枯萎病病原菌母液，接種至 消毒后的麥粒培