用于生產(chǎn)單克隆抗體的改進(jìn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用來獲得大量具有期望帶電變體譜（desired profile of charged variant)之單克隆抗體的改進(jìn)方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還提供了具有期望聚糖 譜（desired profile of glycan)的抗體。所述方法包括在期望分子的生產(chǎn)期間首先在合 適的溫度下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，接著降低所述溫度，并且任選地同時(shí)添加合適的氨基酸。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)是大且復(fù)雜的分子。它們必須處于其天然構(gòu)象（confirmation)以保持生 物活性。此外，在高濃度下，溶液中的蛋白質(zhì)分子在儲(chǔ)存期間易于隨時(shí)間而經(jīng)受聚集或者 降解或者某些修飾。一方面，本發(fā)明提供了用來獲得增加量的期望品質(zhì)產(chǎn)物（優(yōu)選單克隆 抗體）的方法。單克隆抗體（mAb)因其與靶抗原結(jié)合的高度特異性、引起對(duì)靶抗原的免疫 應(yīng)答的能力和長(zhǎng)血清持久性而作為治療劑已經(jīng)獲得明顯關(guān)注。有許多針對(duì)腫瘤特異性抗 原的單克隆抗體。發(fā)現(xiàn)每種免疫球蛋白的一些獨(dú)特的特性特征（例如，帶電性質(zhì)和聚糖結(jié) 構(gòu)）對(duì)作用模式重要和特異。和許多其它蛋白質(zhì)一樣，單克隆抗體具有優(yōu)化靜電相互作用 以及調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、化學(xué)和生物性質(zhì)的電荷異質(zhì)性。在生產(chǎn)期間，由于降解、修飾或多 種酶促過程會(huì)發(fā)生多種形式的微觀異質(zhì)性。蛋白質(zhì)的降解因化學(xué)不穩(wěn)定性或物理不穩(wěn)定性 而發(fā)生。化學(xué)不穩(wěn)定性主要可能是脫酰胺作用、外消旋、水解、氧化、β -消除或二硫鍵交換 (disulfide exchange)的結(jié)果?；瘜W(xué)不穩(wěn)定性導(dǎo)致形成多種帶電變體并因此修飾生物分子 的性質(zhì)。化學(xué)修飾（例如脫酰胺作用和唾液酸化）分別導(dǎo)致mAb上的凈負(fù)電荷增加和引起 pi值的降低。生成酸性變體的其它機(jī)理在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。脫酰胺同種型（isoform) 易于隨活性的喪失而降解，因此其顯著影響單克隆抗體蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性。
[0003] 類似地，F(xiàn)c區(qū)中的N-糖基化調(diào)節(jié)免疫球蛋白和其它含F(xiàn)c分子的抗體效應(yīng)物功能。 Fc聚糖可包含多種不同類型的影響抗體功能的末端糖。末端半乳糖基化的作用對(duì)技術(shù)人 員來說是已知的。不同免疫球蛋白的半乳糖基化模式示出在該免疫球蛋白中的產(chǎn)物特異性 的變化性。重要的是，要注意末端半乳糖基化的變化影響抗體與抗原的結(jié)合，以及確實(shí)極大 地影響分子的CDC活性。另一方面，已知不同程度的半乳糖基化對(duì)ADCC活性具有較小的影 響，然而無巖藻糖基化對(duì)ADCC活性極為重要。
[0004] 本領(lǐng)域中已知有多種單克隆抗體的生產(chǎn)方法。這些方法包括保持重量滲透摩爾濃 度（osmolality)、在降低溫度下添加鹽，等等。
[0005] US 5705364公開了用于控制位于糖蛋白的寡糖側(cè)鏈上之唾液酸的量的細(xì)胞培養(yǎng) 方法，其通過以下來實(shí)現(xiàn)：向培養(yǎng)物添加約0.1 mM至約20mM濃度的鏈燒酸（alkanoic acid) 或其鹽，保持所述培養(yǎng)物的重量滲透摩爾濃度為約250至約600m0sm，以及保持所述培養(yǎng)物 的溫度在約30 °C至35 °C的溫度。
[0006] US 5976833提供了一種用于提高通過動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)有用物質(zhì)時(shí)的生產(chǎn)力的方法。 其公開了一種用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)以生產(chǎn)期望物質(zhì)的方法，包括以下步驟：（1)在所述動(dòng)物 細(xì)胞可以生長(zhǎng)的溫度下培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞；以及（2)在較低的溫度下培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞。
[0007] WO 2014035475公開了一種用于控制重組表達(dá)的蛋白質(zhì)之寡糖分布的方法，其包 括向所述蛋白質(zhì)的重組表達(dá)中所使用的細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充酵母水解產(chǎn)物補(bǔ)充物和植物水解 產(chǎn)物補(bǔ)充物。其還公開了用于通過調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基的天冬酰胺氨基酸濃度來控制抗體之寡 糖分布的方法；但是本發(fā)明不包括這些水解產(chǎn)物在培養(yǎng)基中的補(bǔ)充。
[0008] 盡管存在用于生產(chǎn)單克隆抗體的不同方法的可用性，仍然需要建立一種用于生 產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其始終生成期望水平的帶電變體譜（charged variant profile)和聚糖譜（glycan profile)，而無批次之間的任何明顯變化。這種方法也將有助 于獲得具有期望電荷譜和/或聚糖譜的單克隆抗體蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了這樣一種使用修 改的細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)單克隆抗體的改進(jìn)方法。根據(jù)本發(fā)明的方法不包括鹽的添加或合適 的重量滲透摩爾濃度的保持。本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有期望聚糖譜和帶電變體譜之單克 隆抗體的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了用來使用修改的細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得大量具有期望聚糖譜和帶電變 體譜的單克隆抗體的改進(jìn)方法。
[0010] -方面，細(xì)胞培養(yǎng)方法的特征在于：在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間，以立即或逐步方式保持 細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)條件處于多個(gè)溫度。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)單克隆抗體的改進(jìn)方法，其通過以下來實(shí)現(xiàn)：在 生長(zhǎng)期中于較高的初始溫度下進(jìn)行生產(chǎn)過程，以及接著在對(duì)數(shù)中期至對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期期 間將培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度降低至較低的第二溫度。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供了用于通過在對(duì)數(shù)中期至對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期期間向培養(yǎng)系 統(tǒng)加入（feed)合適的氨基酸來生產(chǎn)單克隆抗體的改進(jìn)方法。
[0013] 再一方面，根據(jù)本發(fā)明，在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間，將氨基酸以一定濃度和特定時(shí)間間 隔添加至細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0014] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸選自谷氨酰胺和天冬酰胺或者其組合。
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于獲得大量具有期望聚糖譜和帶電變 體譜的單克隆抗體的改進(jìn)上游方法，其通過以下來實(shí)現(xiàn)：在生長(zhǎng)期中于較高的初始溫度下 進(jìn)行該方法，以及接著在對(duì)數(shù)中期至對(duì)數(shù)后期期間或在穩(wěn)定期將培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度降低至低 于初始溫度的第二溫度，并向培養(yǎng)基加入氨基酸。
[0016] 再一方面，根據(jù)本發(fā)明的氨基酸選自包含酰胺基的氨基酸以及堿性氨基酸，例如 谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸及其組合。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體選自抗HER抗體、抗TNF抗體、抗VEGF 抗體和抗CD20抗體。
[0018] 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體選自曲妥珠單抗（trastuzumab)、帕 妥珠單抗（pertuzumab)、英夫利單抗（infliximab)、阿達(dá)木單抗（adalimumab)、貝伐單抗 (bevacizumab)、雷珠單抗（ranibizumab)和利妥昔單抗（rituximab)。
【附圖說明】
[0019] 圖1 :通過HP-IEC示出純化的阿達(dá)木單抗蛋白質(zhì)的帶電變體譜。
[0020] 圖2 :通過CE-LIF示出純化的阿達(dá)木單抗蛋白質(zhì)的聚糖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有期望帶電變體譜同時(shí)保持期望蛋 白質(zhì)的聚糖譜之單克隆抗體的方法，其通過以下來實(shí)現(xiàn)：在生長(zhǎng)期中于較高的初始溫度下 進(jìn)行生產(chǎn)過程，以及接著在對(duì)數(shù)中期至對(duì)數(shù)后期期間或在穩(wěn)定期立即或以逐步方式將培養(yǎng) 系統(tǒng)的溫度降低至較低溫度。
[0022] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)方法的特征在于在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間立即或以逐 步方式保持細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)條件處于不同溫度。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)大量具有期望聚糖譜之單克隆抗體 的方法，優(yōu)選通過以下來實(shí)現(xiàn)：向培養(yǎng)系統(tǒng)加入合適的氨基酸（例如包含酰胺基的氨基酸 和/或堿性氨基酸）。這樣的氨基酸可以在對(duì)數(shù)中期至穩(wěn)定期期間的任何階段加入。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間將氨基酸以一定濃度和 特定時(shí)間間隔添加至細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0025] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間至少以兩種不同的間隔 進(jìn)行氨基酸的添加。
[0026] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，以每次低于20mM，優(yōu)選低于10mM的濃度 向細(xì)胞培養(yǎng)基添加氨基酸。
[0027] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了大量具有期望聚糖譜和帶電變體譜的單 克隆抗體，通過以下來實(shí)現(xiàn)：在生長(zhǎng)期中于較高的初始溫度下進(jìn)行生產(chǎn)過程，以及接著在對(duì) 數(shù)中期至對(duì)數(shù)后期期間或在穩(wěn)定期將培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度降低至較低的第二溫度，并且向培養(yǎng) 系統(tǒng)加入氨基酸。
[0028] 另一方面，根據(jù)本發(fā)明的氨基酸選自包含酰胺基的氨基酸和堿性氨基酸，例如谷 氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸及其組合。
[0029] 通常，培養(yǎng)系統(tǒng)的較高的初始溫度保持在37 °C。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度可 以在對(duì)數(shù)中期至穩(wěn)