。除了在初始批次培養(yǎng)基中加入谷氨酰胺，不再進一 步加入谷氨酰胺。
[0068] 將曲妥珠單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚 糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0069] 實施例6
[0070] 將溫度從37°C降低至33°C對曲妥珠單抗的作用：
[0071] 該實驗在生物反應(yīng)器中進行。生長條件與實施例-1相同，包括普通加入物培養(yǎng)基 和除溫度條件以及向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺以外的其它方法參數(shù)。在從對數(shù)期向穩(wěn)定期過 渡期間，將所述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度從37°C降低至33°C。2mM谷氨酰胺的加入始于對數(shù)中期，并 且以特定的間隔繼續(xù)進行，直至期望的單克隆抗體的生產(chǎn)結(jié)束。
[0072] 將曲妥珠單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚 糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0073] 實施例7
[0074] 不加入谷氨酰胺將溫度從37°C降低至35°C對貝伐單抗的作用：
[0075] 該實驗在30L的生物反應(yīng)器（培養(yǎng)瓶）中進行。生長條件與實施例-1相同，包括 普通加入物培養(yǎng)基和除溫度條件以及向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺以外的其它方法參數(shù)。在從 對數(shù)期向穩(wěn)定期過渡期間，將所述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度從37 °C降低至35 °C。除了在初始批次培 養(yǎng)基中加入谷氨酰胺，不再進一步加入谷氨酰胺。
[0076] 將貝伐單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚糖 譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0077] 實施例8
[0078] 整個批次在37°C培養(yǎng)并加入谷氨酰胺對貝伐單抗的作用：
[0079] 該實驗在生物反應(yīng)器中進行。生長條件與實施例-1相同，包括普通加入物培養(yǎng)基 和除溫度條件以及向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺以外的其它方法參數(shù)。在整個批次期間，將所 述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度保持在37°C。4mM谷氨酰胺的加入始于對數(shù)中期，并且以特定的間隔繼 續(xù)進行，直至期望的單克隆抗體的生產(chǎn)結(jié)束。
[0080] 將貝伐單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚糖 譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0081] 實施例9
[0082] 不加入谷氨酰胺整個批次在37°C培養(yǎng)對利妥昔單抗的作用：
[0083] 該實驗在生物反應(yīng)器中進行。生長條件與實施例-1相同，包括普通加入物培養(yǎng)基 和除溫度條件以及向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺以外的其它方法參數(shù)。在整個批次期間，將所 述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度保持在37°C。除了在初始批次培養(yǎng)基中加入谷氨酰胺，不再進一步加入 谷氨酰胺。
[0084] 將利妥昔單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚 糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0085] 實施例10
[0086] 整個批次在37°C培養(yǎng)并加入谷氨酰胺對利妥昔單抗的作用：
[0087] 該實驗在生物反應(yīng)器中進行。生長條件與實施例-1相同，包括普通加入物培養(yǎng)基 和除溫度條件以及向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺以外的其它方法參數(shù)。在整個批次期間，將所 述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度保持在37°C。4mM谷氨酰胺的加入始于對數(shù)中期，并且以特定的間隔繼 續(xù)進行，直至期望的單克隆抗體的生產(chǎn)結(jié)束。
[0088] 將利妥昔單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚 糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0089] 實施例11
[0090] 整個批次在37°C培養(yǎng)并加入谷氨酰胺對曲妥珠單抗的作用：
[0091] 該實驗在30L生物反應(yīng)器（200L生物反應(yīng)器）中進行。生長條件與實施例-1相 同，包括普通加入物培養(yǎng)基和除溫度條件以及向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺以外的其它方法參 數(shù)。在整個批次期間，將所述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度保持在37°C。2mM谷氨酰胺的加入始于對數(shù) 中期，并且以特定的間隔繼續(xù)進行，直至期望的單克隆抗體的生產(chǎn)結(jié)束。
[0092] 將曲妥珠單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚 糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0093] 實施例12
[0094] 不加入谷氨酰胺將溫度從37°C降低至35°C對曲妥珠單抗的作用：
[0095] 該實驗在30L生物反應(yīng)器（培養(yǎng)瓶）中進行。生長條件與實施例-1相同，包括普 通加入物培養(yǎng)基和除溫度條件以及向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺以外的其它方法參數(shù)。在從對 數(shù)期向穩(wěn)定期過渡期間，將所述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度從37 °C降低至35 °C。除了在初始批次培養(yǎng) 基中加入谷氨酰胺，不再進一步加入谷氨酰胺。
[0096] 將曲妥珠單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚 糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0097] 結(jié)果
[0098] 表1 :淵度對多種單克降抗體之帶電物奪體的作用
[0100] 表2 :谷氨酰胺的加入對多種單克降抗體之聚糖譜的作用
[0101]
[0103] 接著，通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)對所得產(chǎn)物進行純化以及適當(dāng)?shù)嘏渲啤?br>【主權(quán)項】
1. 使用修改的細胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)具有需要的聚糖譜和/或帶電物變體譜之抗體的方 法，其中所述細胞培養(yǎng)方法包括： a) 將細胞培養(yǎng)條件以一定間隔保持在合適的溫度條件下； b) 在所述生產(chǎn)抗體方法期間，以一定間隔向培養(yǎng)基同時或順序地添加特定氨基酸。2. 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中細胞培養(yǎng)方法的特征在于：在細胞培養(yǎng)過程期 間，在固定的溫度下或以逐步方式降低溫度，將細胞培養(yǎng)生產(chǎn)條件保持在合適的溫度下。3. 如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其中合適的溫度條件包括：在第一溫度條件下使細 胞生長直至對數(shù)中期，接著將細胞培養(yǎng)條件保持在第二溫度條件和任選地第三溫度條件下 直至所述生產(chǎn)方法結(jié)束。4. 如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其中將所述第一溫度條件保持在高于所述第二溫度 條件和任選地所述第三溫度條件的溫度下。5. 如權(quán)利要求2至5所述的生產(chǎn)方法，其中所述第一溫度條件為約37°C，并且所述第 二溫度條件和任選地所述第三溫度條件為35°C至30°C。6. 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中在細胞培養(yǎng)過程期間將所述氨基酸以一定濃度 和特定時間間隔添加至細胞培養(yǎng)基。7. 如權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法，其中在所述細胞培養(yǎng)過程期間至少以兩種不同的間 隔進行氨基酸添加。8. 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中以每次低于10mM的濃度向細胞培養(yǎng)基添加氨基 酸。9. 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中所述氨基酸選自包含酰胺基的氨基酸和堿性氨 基酸，例如谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸及其組合。10. 如前述任一項權(quán)利要求所述的生產(chǎn)方法，其中將葡萄糖濃度保持在〇. 5g/L至8g/ L，優(yōu)選 2g/L至 4g/L。11. 如前述任一項權(quán)利要求所述的生產(chǎn)方法，其中通過使用合適的緩沖劑使pH保持在 pH6至pH7. 5,所述緩沖劑選自碳酸氫鈉緩沖劑、碳酸鈉緩沖劑和HEPES緩沖劑。12. 如前述任一項權(quán)利要求所述的生產(chǎn)方法，其中細胞生產(chǎn)力不低于0. 5g/L，優(yōu)選lg/ L至 4g/L。13. 如前述任一項權(quán)利要求所述的生產(chǎn)方法，其中保持細胞活力不低于30%，優(yōu)選約 80%，更優(yōu)選大于95 %。14. 如前述任一項權(quán)利要求所述的生產(chǎn)方法，其中抗體選自抗HER抗體、抗TNF抗體、抗 VEGF抗體和抗CD20抗體。15. 如前述任一項權(quán)利要求所述的生產(chǎn)方法，其中抗體選自曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、 英夫利單抗、阿達木單抗、貝伐單抗、雷珠單抗和利妥昔單抗。
【專利摘要】本發(fā)明提供了用來獲得大量具有期望帶電變體譜的單克隆抗體的改進方法。所述方法包括在期望分子的生產(chǎn)期間，首先在合適的溫度下培養(yǎng)哺乳動物細胞，隨后降低所述溫度，以及任選地同時添加合適的氨基酸。本發(fā)明還提供了使用所述改進方法制備的具有期望聚糖譜的抗體。
【IPC分類】C07K16/28, C07K16/32, C07K16/22, C07K16/24
【公開號】CN105431454
【申請?zhí)枴緾N201480038458
【發(fā)明人】桑吉夫·庫瑪·門迪拉塔, 桑賈伊·班迪奧帕迪亞伊, 桑賈伊·帕特爾
【申請人】卡迪拉保健有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2014年7月7日
【公告號】CA2917484A1, EP3019528A1, WO2015004679A1