定期期間的任何階段立即或以特定時間間隔逐步降低至30°C。根據(jù)本發(fā) 明的方法提供了大量具有期望聚糖譜和帶電變體譜的單克隆抗體。此外，所述方法保持了 單克隆抗體的期望聚糖譜。
[0030] 在一個實施方案中，本發(fā)明通過在對數(shù)中期至穩(wěn)定期期間的任何階段向培養(yǎng)系統(tǒng) 加入合適的氨基酸（例如谷氨酰胺和/或天冬酰胺）提供了蛋白質(zhì)（優(yōu)選單克隆抗體）的 期望聚糖譜。所添加的氨基酸的量為1至4mM，優(yōu)選2至3mM。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明在生產(chǎn)期間 向細胞培養(yǎng)基加入谷氨酰胺和/或天冬酰胺以產(chǎn)物特異性方式增加了單克隆抗體蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)中期望聚糖部分的形成。
[0031] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了大量具有期望聚糖譜和帶電變體譜的單 克隆抗體的生產(chǎn)，其通過以下來實現(xiàn)：在生長期中于較高的初始溫度下進行該過程，以及接 著在對數(shù)中期至對數(shù)后期期間或在穩(wěn)定期將培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度降低至較低的第二溫度；并且 在生產(chǎn)期望蛋白質(zhì)期間通過添加合適的氨基酸（谷氨酰胺和/或天冬酰胺）。
[0032] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有期望聚糖譜和帶電變體譜之抗體 的方法，其中將葡萄糖濃度保持在0. 5g/L至8g/L，優(yōu)選2g/L至4g/L，更優(yōu)選約2. 5g/L。
[0033] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有期望聚糖譜和帶電變體譜的抗 體的方法，其中在生產(chǎn)期間通過使用合適緩沖劑使pH保持在pH 6至pH 7. 5,所述緩沖劑選 自碳酸氫鈉緩沖劑、碳酸鈉緩沖劑和HEPES緩沖劑。
[0034] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有期望聚糖譜和帶電變體譜的抗 體的方法，其中保持細胞生產(chǎn)力不低于0. 5g/L，優(yōu)選lg/L至4g/L。
[0035] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有期望聚糖譜和帶電變體譜的抗 體的方法，其中保持細胞活力（viability)不低于30%，優(yōu)選約80%，更優(yōu)選大于95%。
[0036] 在一個更優(yōu)選的實施方案中，單克隆抗體選自曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、英夫利單 抗、阿達木單抗、貝伐單抗、雷珠單抗和利妥昔單抗。
[0037] 宙義：
[0038] 魯聚糖：術(shù)語"聚糖"指多糖或者寡糖。聚糖可以是單糖殘基的均聚物或者異聚物， 并且可以是線性的或者分支的。聚糖也可用來指糖綴合物（如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖） 的碳水化合物部分。
[0039] ?期望聚糖譜（Desired Glycan profile):它可以被定義為連接至蛋白質(zhì)的多種 聚糖分子的分布模式，這是其生物活性所必需的。
[0040] ?對數(shù)中期：它被定義為培養(yǎng)基中細胞的生長期，其間細胞群呈指數(shù)增加。該階段 由生長曲線的一部分表示，當(dāng)針對時間繪制細胞群的對數(shù)值時，生長曲線之表現(xiàn)為直線段 稱作對數(shù)期，并且將其中點稱為對數(shù)中期。
[0041] ?對數(shù)后期：它被定義為處于過渡至穩(wěn)定期之前的對數(shù)后期的細胞生長期。該階 段由生長曲線的一部分表示，當(dāng)針對時間繪制細胞群的對數(shù)值時，生長曲線之表現(xiàn)為直線 段的部分稱作對數(shù)期，并且將其末期稱為對數(shù)后期。
[0042] ?穩(wěn)定期：培養(yǎng)基中的細胞在對數(shù)期生長之后，生長曲線的平臺，此時細胞群保持 恒定，將其稱為穩(wěn)定期。新細胞以與衰老細胞死亡相同的速率產(chǎn)生。
[0043] ?帶電物變體（charge species variant):它是蛋白質(zhì)的特性，其優(yōu)化靜電相互 作用以及調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、化學(xué)和生物性質(zhì)。因蛋白質(zhì)分子上的帶電氨基酸的特定分 布，其在不同蛋白質(zhì)之間變化。
[0044] 本發(fā)明中所伸用的分析方法:
[0045] 高壓離子交換色譜法（HP-IEC):通過使用分析型HP-弱陽離子交換色譜法對純化 的單克隆抗體（如阿達木單抗）的不同帶電變體進行分離。在pH 6. 9的磷酸鈉緩沖液（流 動相A)中平衡柱。在0.5mL/分鐘的流動相A中，使用鹽濃度不斷提高的氯化鈉對所述蛋 白質(zhì)的帶電物變體進行洗脫。
[0046] 毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光（CE-LIF):在通過PNGase處理從所述蛋白質(zhì)中分離 碳水化合物部分后，通過CE-LIF法對純化的單克隆抗體制備物（如阿達木單抗）進行聚糖 分析（糖基化變體）。在酶促處理后，通過APTS (8-氨基芘1，2,6-三磺酸鹽）標(biāo)記所述碳水 化合物（聚糖）部分，然后通過毛細管系統(tǒng)（N-CH0包被；50cmX50ym)基于流體力學(xué)尺寸 分離衍生的聚糖。針對標(biāo)記的葡萄糖梯（glucose ladder)標(biāo)準(zhǔn)物鑒定聚糖，其使用488nm 的激發(fā)波長和520nm的發(fā)射波長通過LIF檢測器進行檢測。
[0047] 通過下列實施例舉例說明根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體生產(chǎn)方法的優(yōu)選方式，這些實 施例不應(yīng)該理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍：
[0048] 實施例1
[0049] 通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)生成表達抗TNFa抗體阿達木單抗的哺乳動物細胞。對 克隆進行有限稀釋以獲得單細胞衍生的同質(zhì)群。將所述細胞以細胞庫（cell bank)的形式 冷凍保存，并且用于進一步培養(yǎng)。使用一系列接種物培養(yǎng)步驟復(fù)蘇并擴增細胞，并且將其接 種于包含合適生長培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中。當(dāng)需要時，在通過使用C02氣體和/或碳酸氫 鈉保持pH 7. 2±0. 4的受控環(huán)境中進行細胞培養(yǎng)。使用噴射空氣和/或氧氣以及通過控 制所述生物反應(yīng)器中的攪拌速度，使溶解氧的濃度保持在40 ±20 %飽和度。將溫度控制在 37°C。生長培養(yǎng)基包含下列組分：
[0050] 組分 來度 Ο?Ο生長粉末培養(yǎng)基 19.8 g/L 碳酸氫鈉 2.2 g/L 普朗尼克F-68 1.2 g/L
[0051] 細胞在上述條件下生長兩天。從第三天起開始加入，直至批次（batch)結(jié)束。將 下列培養(yǎng)基組分作為普通加入物加入細胞培養(yǎng)基。
[0052] 組分 濃度每升 CHO基礎(chǔ)粉末培養(yǎng)基 138.9 g 胰島素 50 mg 脂質(zhì)補充物 lx濃度 檸檬酸鐵 lx濃度 聚乙二醇 220 mg 碳酸氫鈉 10.8 g
[0053] 收獲第13天至第18天培養(yǎng)的批次。細胞澄清化后，再調(diào)整（recondition)包含 阿達木單抗的上清液以基本匹配下一步純化柱平衡條件。將期望的蛋白質(zhì)純化至滿意的水 平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。此處 例示的方法可以用于任何期望的抗體。
[0054] 實施例2
[0055] 將溫度從37°C降低至35°C對阿達木單抗的作用
[0056] 該實驗在30L生物反應(yīng)器中進行。生長條件與實施例-1相同，包括普通加入物培 養(yǎng)基和除培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度條件以外的其它方法參數(shù)。在對數(shù)后期，將所述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度 從37°C降低至35°C。將阿達木單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶 電物變體和聚糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0057] 實施例3
[0058] 加入谷氨酰胺對阿達木單抗的作用
[0059] 該實驗在30L生物反應(yīng)器中進行。生長條件與實施例-1相同，包括普通加入物培 養(yǎng)基和除向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺氨基酸以外的其它方法參數(shù)。2mM谷氨酰胺的加入始于 細胞生長的對數(shù)中期，并且以特定間隔繼續(xù)進行，直至生產(chǎn)結(jié)束。
[0060] 將阿達木單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚 糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0061] 實施例4
[0062] 降低溫度并加入谷氨酰胺對阿達木單抗的作用
[0063] 該實驗在30L生物反應(yīng)器中進行。生長條件與實施例-1相同，包括普通加入物培 養(yǎng)基和除溫度條件以及向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺以外的其它方法參數(shù)。在對數(shù)中期，將所 述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度從37°C降低至35°C，此后，在從對數(shù)期向穩(wěn)定期過渡期間，將所述培養(yǎng) 系統(tǒng)的溫度進一步降低至33°C。3mM谷氨酰胺的加入始于對數(shù)中期，并且以特定的間隔繼 續(xù)進行，直至期望的單克隆抗體的生產(chǎn)結(jié)束。
[0064] 將阿達木單抗純化至滿意的水平，并如表1和表2中所示，分別對帶電物變體和聚 糖譜進行HP-IEC和CE-LIF分析。
[0065] 實施例5
[0066] 不加入谷氨酰胺在37°C溫度下培養(yǎng)對曲妥珠單抗的作用：
[0067] 該實驗在生物反應(yīng)器中進行。生長條件與實施例-1相同，包括普通加入物培養(yǎng)基 和除溫度條件以及向培養(yǎng)系統(tǒng)加入谷氨酰胺以外的其它方法參數(shù)。在整個批次持續(xù)時間 內(nèi)，將所述培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度保持在37°C