三型金屬蛋白酶(timp-3)組織抑制劑的變體、組合物和方法
【專利說明】Ξ型金屬蛋白酶(TIMP-3)組織抑制劑的變體、組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請主張2013年3月14日提交的美國臨時申請?zhí)?1/782,613;2013年3月15日提 交的美國臨時申請?zhí)?1/798,160; 2013年3月18日提交的美國臨時申請?zhí)?1/802,988和 2014年2月17日提交的美國臨時申請?zhí)?1 /940，673的權(quán)益，將所述申請W引用的方式整體 并入本文。
[0003] 對序列表的引用
[0004] 本申請連同序列表一起W電子格式提交。序列表作為2014年3月11日創(chuàng)建的標(biāo)題 為A-1827W0PCT_^31314的文件提供，其大小是30服B。電子格式的序列表中的信息W引用 的方式整體并入本文。
[000引發(fā)明領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明一般設(shè)及金屬蛋白酶抑制劑。具體來講，本發(fā)明設(shè)及金屬蛋白酶3ΓΤΙΜΡ-3")的組織抑制劑和新穎、有用的變體、突變蛋白及其衍生物。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] 結(jié)締組織和關(guān)節(jié)軟骨通過胞外基質(zhì)合成和降解的相對作用維持動態(tài)平衡。基質(zhì)降 解主要是通過金屬蛋白酶的酶促作用造成的，包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和具有凝血栓蛋 白基序的去整合素-金屬蛋白酶(ADAMTS)。雖然運(yùn)些酶在許多自然過程(包括發(fā)育、形態(tài)形 成、骨重塑、創(chuàng)傷愈合和血管生成）中是重要的，但是導(dǎo)致酶水平升高的運(yùn)些酶的失調(diào)被認(rèn) 為在結(jié)締組織降解性疾病(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎）中W及在癌癥和屯、血管病狀 中發(fā)揮不利作用。
[0009] 金屬蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑包括血漿α2-巨球蛋白和金屬蛋白酶的組織抑制劑 (ΤΙΜΡ)，其中有四種已知在人類基因組中編碼。ΤΙΜΡ-3抑制所有主要的軟骨降解金屬蛋白 酶，有多重證明表明它保護(hù)軟骨。向軟骨外植體添加所述蛋白質(zhì)預(yù)防細(xì)胞因子誘導(dǎo)的降解， 并且關(guān)節(jié)內(nèi)注射減少骨關(guān)節(jié)炎大鼠內(nèi)側(cè)半月板損傷模型中的軟骨損傷。
[0010] ΜΜΡ的失調(diào)還出現(xiàn)充血性屯、力衰竭中并且被認(rèn)為在眾多促炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮作 用。然而，作為ΜΜΡ活性的治療抑制劑開發(fā)ΤΙΜΡ-3已經(jīng)受到重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)W及ΤΙΜΡ-3重組 形式半衰期短的挑戰(zhàn)所阻礙。因此，本領(lǐng)域需要顯示良好的生產(chǎn)、純化和藥動學(xué)/藥效學(xué)性 質(zhì)的形式的ΤΙΜΡ-3。
[0011] 附圖簡述
[001引圖1呈現(xiàn)天然的全長人ΤΙΜΡ-3和突變形式的全長人ΤΙΜΡ-3的比對，其中字母?'已 經(jīng)置換為所述序列內(nèi)的具體氨基酸。信號序列有下劃線；因此其他信號序列可W被置換，如 本文所述。
[0013] 圖2呈現(xiàn)天然的全長人ΤΙΜΡ-3,和某些氨基酸置換已經(jīng)完成的ΤΙΜΡ-3變體的比對。 呈現(xiàn)信號序列并且對于天然的全長ΤΙΜΡ-3序列加 W下劃線W保持編號的一致性;其他信號 序列可W因此置換，如本文所述。
[0014] 圖3呈現(xiàn)二維多膚圖像，其中氨基酸經(jīng)排列W確定包含ΤΙΜΡ-3的Ν-結(jié)構(gòu)域(殘基 23-143)和C-結(jié)構(gòu)域(144-211)的那些殘基、W及形成二硫鍵的半脫氨酸位置。
[001引圖4呈現(xiàn)天然的人N末端TIMP3和突變形式的人N末端TIMP3的比對，其中字母?'已 經(jīng)置換為所述序列內(nèi)的具體氨基酸。信號序列加 W下劃線；因此其他信號序列可W被置換， 如本文所述。設(shè)想在成熟形式的Ν末端ΤΙΜΡ-3中的某些置換，并且在本文中表示為其 中V'表示TIMP-3的天然的N末端結(jié)構(gòu)域中的氨基酸，"r表示氨基酸殘基數(shù)目，且V'表示 已被置換的氨基酸Γ-"表示氨基酸已缺失）。因此，例如，"Κ45Γ指示在氨基酸45處的賴氨 酸化）已被異亮氨酸（I)置換。M67缺失通過M67-表示。用一對甘氨酸置換殘基71-77通過 Y70-GG-H78表示。本文中示例的突變形式的人TIMP-3包括W下突變（單獨或組合）：R43F、 K45I、K45T、K53T、E54Y、K65T、M67-、K68T、K68I、Y70-GG-H78、H78W。突變的特定組合包括 K45I、K53T、E54Y、K65T、M67-、K68T;K45I、K53T、E54Y、M67-、K68I;K45I、K53T、K65T、M67-、 K68T;K45I、K53T、M67-、K68I;K45I、K53T、M67-、K68I、H78W;K45I、K65T、K68I;K45I、K65T、 M67-、K68T;K45I、K65T、M67-、K68T、H78W;K45I、M67-、K68I、H78W;K45I、M67-、K68T;K45T、 K65T、M67-、K68I;K45T、K65T、M67-、K68T;K53T、E54Y;K53T、H78W;R43F、K45I、K65T、K68I。
[0016] 圖5呈現(xiàn)天然的人Ν末端T1MP3和突變形式的人Ν末端TIMP3的比對，其中字母?'已 被置換為所述序列內(nèi)的具體氨基酸。信號序列加 W下劃線；因此其他信號序列可W被置換， 如本文所述。設(shè)想在Ν末端ΤΙΜΡ-3的成熟形式中的某些置換，并且在本文中表示為其 中V'表示TIMP-3的天然的N末端結(jié)構(gòu)域中的氨基酸，"r表示氨基酸殘基數(shù)目，且V'表示 已被置換的氨基酸表示氨基酸已缺失）。因此，例如，"K45E"指示在氨基酸45處的賴氨 酸化)已被谷氨酷胺化)置換。本文中示例的突變形式的人TIMP-3包括W下突變(單獨或組 合）：T25G;T25H;T25K;T25P;T25R;T25S;T25W;C26A;S27V;S27A;P28A;P28D;P2^;P28S; S29I;H30A;P31A;Q32A;F35A;C36A;N37A;D39A;V41A;142A;R43A;R43E;R43T;K4祀；V46A; G48A;G48S;K49S;K4犯；L51E;L51T;K53D;E54S;P56N;L60I;V61Q;T63E;T74E;H78D;H78E; Q80E;G116T;C118A;N119D;C143A;和144N-。特定的突變組合包括：S27VS29I;V46AG48S K49E L51E K53D E54S P56N L60I V61Q G116T N119D；C26A C118A；C36A C143A；K45E Κ4犯；Κ4祀 K49S;K4祀 Q80E;K4祀 T63E;K45E T63E H78E;K4祀 T63E H78E Q80E;L51 Τ T74E H78D；R43E T74E H78D Q80E；R43T T74E H78D Q80E；T63E H78D；T63E H78E；T63E H78E Q80E;T63E T74E H78D;T63E T74E H78E;T74E H78D Q80E;T74E H78E Q80E;Y70-GG-7細(xì)。
[0017] 圖6呈現(xiàn)天然TIMP-2和天然TIMP-3的比對。相應(yīng)殘基中的氨基酸的同一性由序列 下面的星號標(biāo)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離TIMP-3突變蛋白，其具有在氨基酸序列 方面與SEQ ID N0:2中所示的TIMP-3的成熟區(qū)有至少95%同一性的成熟區(qū)，具有至少一個 突變，所述突變選自由 W下組成的組:K45E;K45N;K45S; V47T;K49N;K4犯;K49S;K50N; L51T; L51N；V52T；K53T；P56N；F57N；G58T；T63E；T63N；K65T；K65N；M67T；K68S；T74E；K75N；P77T； H78D；H78E；H78N；Q80E；Q80T；K94N；E96T；E96N；V97N；N98T；K99T；D110N；K112T；Q126N； K133S；R138T；R138N；H140T；T158N；K160T；T166N；M168T；G173T；H181N；A183T；R186N； R186Q、R18 犯、K188T;K188Q、K188E、P201N;K203T;1205F、I205Y、A208G、A208V和A208Y。
[0019] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供一種分離TIMP-3突變蛋白，其具有在氨基酸 序列方面與SEQ ID NO: 2中所示的TIMP-3的成熟區(qū)有至少95%同一性的成熟區(qū)，具有突變 巧7N和至少一個其他突變，其中所述突變是在TIMP-3的一個或多個K殘基處的置換。在本發(fā) 明的又一個方面中，所述其他突變向氨基酸序列中引入N-連接的糖基化位點。
[0020] 本發(fā)明中還設(shè)及一種分離TIMP-3突變蛋白，其具有在氨基酸序列方面與SEQ ID N0:2中所示的TIMP-3的成熟區(qū)有至少90%同一性的闡述去，其中所述突變蛋白具有至少一 個向氨基酸序列中引入至少一個N-連接的糖基化位點的突變蛋白。在另一個實施方案中， 所述TIMP-3突變蛋白具有兩個、Ξ個、四個、五個或六個N-連接的糖基化位點；在又一個實 施方案中，引入的N-連接的糖基化位點的數(shù)目是屯個、八個、九個或十個。
[0021] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述N-連接的糖基化位點是在選自由W下組成的組 的所述TIMP-3氨基酸序列的區(qū)域引入的:包含氨基酸48-54的區(qū)域;包含氨基酸93-100的區(qū) 域;包含氨基酸121-125的區(qū)域;包含氨基酸143-152的區(qū)域;氨基酸156-164;包含氨基酸 183-191的區(qū)域;及其組合。在另一個實施方案中，所述TIMP-3突變蛋白具有兩個、Ξ個、四 個或五個N-連接的糖基化位點；在又一個實施方案中，引入的N-連接的糖基化位點的數(shù)目 是六個、屯個、八個、九個或十個。
[0022] 還提供一種分離TIMP-3突變蛋白，其具有在氨基酸序列方面與SEQ ID N0:2中所 示的TIMP-3的成熟區(qū)有至少95%同一性的成熟區(qū)，其中所述突變蛋白具有至少一個選自由 W下組成的組的突變：（a)TIMP-3表面暴露的帶正電膜片(patch)中的一個或多個突變，導(dǎo) 致模擬TIMP-2帶電表面的TIMP-3帶電膜片的特征的改變；（b) -個或多個降低對蛋白水解 裂解敏感度的突變；（C)一個或多個導(dǎo)致TIMP-3突變蛋白與清除受體LRP-1相互作用降低的 突變；（d) -個或多個導(dǎo)致TIMP-3突變蛋白肝素或胞外基質(zhì)組分的相互作用降低的突變； (e)向天然TIMP-3序列添加一個或多個半脫氨酷殘基；（f)改善的藥動學(xué)和/或藥效學(xué)性質(zhì)； 和(g)(a)-(f)中所示的突變的組合。在一個實施方案中，所述突變是在選自由W下組成的 組的TIMP-3氨基酸序列的區(qū)域引入的：包含氨基酸48-54的區(qū)域;包含氨基酸93-100的區(qū) 域;包含氨基酸121-125的區(qū)域;包含氨基酸143-152的區(qū)域;氨基酸156-164;包含氨基酸 183-191的區(qū)域;及其組合。
[0023] 本發(fā)明的一個方面是編碼根據(jù)上述TIMP-3突變蛋白的任一種的TIMP-3突變蛋白 的分離核酸。本發(fā)明的其他方面是包括運(yùn)種分離核酸的表達(dá)載體；用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或 轉(zhuǎn)染的分離宿主細(xì)胞;和產(chǎn)生重組TIMP-3突變蛋白的方法，所述方法包括在促進(jìn)TIMP-3突 變蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞W及回收所述TIMP-3突變蛋白。
[0024] 還提供包含本文中描述的TIMP-3突變蛋白的組合物，W及治療病狀的方法，所述 病狀中被TIMP-3抑制或可被TIMP-3抑制的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和/或其他蛋白酶起成因 或加重作用，所述方法包括對患有運(yùn)種病狀的個體施用足W治療所述病狀的量的運(yùn)種組合 物。
[0025] 在一個實施方案中，所述病狀選自由炎性病狀、骨關(guān)節(jié)炎、屯、肌缺血、再灌注損傷 和發(fā)展成充血性屯、力衰竭組成的組。在另一個實施方案中，所述病狀選自由哮喘、慢性阻塞 性肺病(C0PD)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)、炎性腸病(例如，潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病和脂瀉 ?。y屑病、屯、肌炎(包括病毒屯、肌炎）、動脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥、和關(guān)節(jié)炎病狀(包括類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎)組成的組。
[0026] 在又一個實施方案中，所述病狀選自由W下組成的組：營養(yǎng)不良性大瘤型表皮松 解癥、骨關(guān)節(jié)炎、萊特爾氏綜合征、假性痛風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(包括青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）、 強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、牙周病、潰瘍(包括角膜、表皮或胃潰瘍）、手術(shù)后創(chuàng)傷愈合、再狹窄、 肺氣腫、骨佩吉特氏病、骨質(zhì)疏松、硬皮病、稱瘡中的骨或組織的壓迫性萎縮、膽脂瘤、異常 創(chuàng)傷愈合、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、少關(guān)節(jié)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多關(guān)節(jié)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性發(fā)作 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、腸道致病關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、萊特爾氏綜合征、SEA綜 合征(血清陰性、肌腫端病、關(guān)節(jié)病綜合征）、皮肌炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼 瘡、脈管炎、肌炎、多肌炎、皮肌炎、骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、韋格納肉芽腫、動脈炎、風(fēng)濕 性多肌痛、結(jié)節(jié)病、硬化癥、原發(fā)性膽汁硬化癥、硬化性膽管炎、干燥綜合征、銀屑病、斑塊狀 銀屑病、滴狀銀屑病、反轉(zhuǎn)性銀屑病、脈瘤性銀屑病、紅皮病型銀屑病、皮炎、特應(yīng)性皮炎、動 脈粥樣硬化、狼瘡、斯蒂爾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、重癥肌無力、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸 炎、克羅恩氏病、脂瀉病(非熱帶性口炎性腹瀉）、與血清陰性關(guān)節(jié)病有關(guān)的腸病、顯微或膠 原結(jié)腸炎、嗜酸細(xì)胞性胃腸炎、或直腸結(jié)腸切除術(shù)和回腸肛管吻合術(shù)后造成的囊炎、膜腺 炎、膜島素依賴性糖尿病、乳腺炎、膽囊炎、膽管炎、膽管周炎、多發(fā)性硬化(MS)、哮喘（包括 外因性和內(nèi)因性哮喘W及相關(guān)的慢性炎性病狀或氣道的高反應(yīng)性）、慢性阻塞性肺病 (COPD，即慢性支氣管炎、肺氣腫）、急性呼吸道素亂綜合征(ARDS)、呼吸窘迫綜合征、囊性纖 維化、肺動脈高血壓、肺部血管收縮、急性肺損傷、過敏性支氣管肺曲霉病、過敏性肺炎、嗜 酸細(xì)胞性肺炎、支氣管炎、過敏性支氣管炎支氣管擴(kuò)張、結(jié)核、過敏性肺炎、職業(yè)性哮喘、哮 喘樣病癥、類肉瘤、反應(yīng)性氣道疾病(或功能素亂)綜合征、棉塵肺、間質(zhì)肺病、高嗜酸細(xì)胞性 綜合征、鼻炎、鼻竇炎和寄生肺病、與病毒誘發(fā)的病狀有關(guān)的氣道高反應(yīng)性(例如，呼吸道合 胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、鼻病毒(RV)和腺病毒）、Guillain-Barre病、格雷夫斯病、 阿狄森氏病、雷諾現(xiàn)象、自身免疫性肝炎、移植物抗宿主病(GVHD )、腦缺血外傷性腦損傷、多 發(fā)性硬化、神經(jīng)病、肌病、脊髓損傷和肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。
[0027] 發(fā)明詳述
[0028] 本發(fā)明提供與TIMP-3多膚、變體、衍生物或突變蛋白有關(guān)的組合物、試劑盒和方 法。還提供核酸及其衍生物和片段，包括編碼運(yùn)種TIMP-3多膚、變體、衍生物或突變蛋白的 全部或一部分的核巧酸序列，例如，編碼運(yùn)種TIMP-3多膚、變體、衍生物或突變蛋白的全部 或一部分的核酸;包含運(yùn)種核酸的質(zhì)粒和載體，W及包含運(yùn)種核酸和/或載體和質(zhì)粒的細(xì)胞 或細(xì)胞系。提供的方法包括例如，制造、鑒別或分離顯示希望的性質(zhì)的TIMP-3多膚、變體、衍 生物或突變蛋白的方法。
[0029] 在存在的眾多病狀中，增加哺乳動物中的內(nèi)源性TIMP-3或升高特定組織中的 TIMP-3的水平是有利的。因此，本文中還提供制造包括TIMP-3多膚、變體、衍生物或突變蛋 白的組合物(諸如藥物組合物)的方法，W及對受試者(例如，患有其中基質(zhì)金屬蛋白酶活性 失調(diào)導(dǎo)致過度或不當(dāng)組織重塑的病狀的受試者)施用包括TIMP-3多膚、變體、衍生物或突變 蛋白組合物的方法。
[0030] 除非在本文中另外定義，否則結(jié)合本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)該具有本領(lǐng)域 技術(shù)人員通常所理解的含義。此外，除非另外通過上下文要求，否則單數(shù)的術(shù)語應(yīng)該包括復(fù) 數(shù)并且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)該包括單數(shù)。一般來講，結(jié)合本文中描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物 學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)及核酸化學(xué)W及雜交使用的命名法W及其技術(shù)是本 領(lǐng)域眾所周知并且常用的那些。除非另外指出，否則本發(fā)明的方法和技術(shù)通常是按照本領(lǐng) 域熟知的傳統(tǒng)方法并且如貫穿本說明書引用和討論的各種一般和更具體的參考文獻(xiàn)所述 進(jìn)行的。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoiT Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press ,Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和Ausubel等， Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992);W 及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratoiy Press，Cold Spring Ha;rbo;r，N.Y. (1990)，所述參考文獻(xiàn)W 引用的方式并入本 文。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)是根據(jù)制造商說明書，如本領(lǐng)域中通常所達(dá)成或如本文所述來執(zhí) 行。結(jié)合本文中描述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)和醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)使用的術(shù)語及其實驗室 操作和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知并且是常用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可W用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、 藥物制劑、配制和輸送W及患者治療。
[0031] 除非另外指出，否則W下術(shù)語應(yīng)被理解為具有W下含義：
[0032] 用于表征分子(其中所述分子是，例如，多膚、多核巧酸或抗體)的術(shù)語"分離"表明 所述分子根據(jù)其來源或衍生源（1)與伴隨其天然狀態(tài)的天然相關(guān)組分無關(guān)，（2)基本上沒有 來自相同物種的其他分子(3)由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或(4)沒有人的干預(yù)下不出現(xiàn)在 自然界中。因此，化學(xué)合成或在不同于它所天然起源的細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的分子將是 與其天然相關(guān)組分"分離"的。分子還可W使用本領(lǐng)域熟知的純化技術(shù)分離變成基本上沒有 天然相關(guān)組分。分子純度或均一性可W通過若干本領(lǐng)域熟知的方法測定。例如，多膚樣品的 純度可W使用聚丙締酷胺凝膠電泳W(wǎng)及使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)對凝膠染色使多膚可視化 來測定。為了某些目的，通過使用HPLC或本領(lǐng)域熟知的其他純化方法可W提供更高的分辨 率。
[0033] 術(shù)語"膚"、"多膚"和"蛋白"各自是指包含兩個或兩個W上彼此通過膚鍵連接的氨 基酸殘基的分子。運(yùn)些術(shù)語涵蓋，例如，天然和人造蛋白質(zhì)、蛋白序列的蛋白質(zhì)片段和多膚 類似物(如突變蛋白、變體和融合蛋白）W及翻譯后或此外共價或非共價修飾的蛋白質(zhì)。膚、 多膚或蛋白質(zhì)可W是單體或聚合的。
[0034] 本文使用的術(shù)語"多膚片段"是指與相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)相比具有氨基末端和/或簇 基末端缺失的多膚。片段長度可W是例如，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、 80、90、100、150或200個氨基酸。片段長度還可^是，例如，最多1，000、750、500、250、200、 175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10個氨基酸。片段還可^ 包括(在其一個末端或兩個末端的）一個或多個其他氨基酸，例如，來自不同天然存在的蛋 白質(zhì)的氨基酸序列(例如，F(xiàn)c或亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu))或人造氨基酸序列(例如，人造連接序列或 標(biāo)簽蛋白）。
[003引多膚的"變體"或"突變蛋白"（例如TIMP-3變體或突變蛋白飽含W下氨基酸序列： 其中相對于另一多膚序列，在所述氨基酸序列中插入、缺失和/或置換有一個或多個氨基酸 殘基。本發(fā)明的變體包括融合蛋白。
[0036]"保守性氨基酸取代"是基本上不改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征的取代(例如，置換氨 基酸不應(yīng)傾向于打斷親本序列中存在的螺旋，或破壞表征親本序列的其他類型的二級結(jié)構(gòu) 或是其功能所必需的）。本領(lǐng)域公認(rèn)的多膚二級和Ξ級結(jié)構(gòu)的實例在Proteins，St;ruc化res and Molecular Principles(Creighton編著，W.Η.Freeman and Company ,New York (1984)) ； Introduction to Protein Structure (C. Branden和J. Tooze編著，Garland Publ ishing，化w 化rk，N. Υ. (1991));和Thormon等，化化re 354:105 (1991)中描述，將其各 自W引用方式并入本文。
[0037] 參考變體或突變蛋白與天然蛋白的相似度的一種方式是參考比較的兩種（或更 多）多膚序列或編碼核酸序列之間的一致性百分比。兩種多核巧酸或兩種多膚序列的"一致 性百分比"是通過使用GAP計算機(jī)程序（GCG Wisconsin Package的一部分，10.3版 Acceliys，San Diego，CA))用其默認(rèn)參數(shù)比較所述序列確定的。
[0038] 多膚的"衍生物"是已經(jīng)例如借助于與另一個化學(xué)部分(例如，聚乙二醇或白蛋白， 例如，人血清白蛋白）綴合、憐酸化和/或糖基化化學(xué)修飾的多膚(例如，TIMP-3多膚、變體或 突變蛋白）。
[0039] 多核巧酸和多膚序列使用標(biāo)準(zhǔn)的一個或Ξ個字母縮寫指示的。除非另外指出，否 則每個多膚序列在左邊具有氨基末端并且在右邊具有簇基末端;每個單鏈核酸序列和每個 雙鏈核酸序列的上鏈在左邊具有5'末端并且在右邊具有3'末端。具體的多膚或多核巧酸序 列還可W通過說明其怎樣與引用序列不同來描述。例如，氨基酸的置換在本文中表示為"n# m"，其中V'表示天然的全長多膚中發(fā)現(xiàn)的氨基酸，"r表示氨基酸殘基數(shù)目，V'表示已被 置換的氨基酸。
[0040] 術(shù)語"多核巧酸"、"寡核巧酸"和"核酸"自始至終可互換使用并且包括DNA分子(例 如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核巧酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物 (例如，膚核酸和非天然存在的核巧酸類似物)及其雜化物。核酸分子可W是單鏈或雙鏈。在 一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括編碼本發(fā)明的TIMP-3多膚、片段、變體、衍生物或 突變蛋白的連續(xù)開放閱讀框。
[0041] 如果兩個單鏈多核巧酸的序列可反平行取向比對使得在不引入缺口 W及在 任何一個序列的5'或3'端沒有未配對核巧酸的情況下一個多核巧酸中的每個核巧酸與另 一個多核巧酸中的其互補(bǔ)核巧酸相對，那么兩個單鏈多核巧酸就是彼此的"互補(bǔ)序列"。如 果所述兩個多核巧酸可W在適當(dāng)嚴(yán)格的條件下彼此雜交，那么多核巧酸就與另一個多核巧 酸"互補(bǔ)"。因此，多核巧酸可W與不是其互補(bǔ)序列的另一個多核巧酸互補(bǔ)。
[0042] "載體"是可W用于向細(xì)胞中引入與其連接的另一個核酸的核酸。一種類型的載體 是"質(zhì)粒"，其是指其中可接合其他核酸片段的線性或環(huán)狀雙鏈DNA。另一種類型的載體是病 毒載體(例如，復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒），其中可W向所述病毒基因 組中引入其他DNA片段。某些載體能夠在它們被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制（例如，包含細(xì) 菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體）。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體） 可在引入到宿主細(xì)胞中之后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并且由此與宿主基因組一起復(fù) 審IJ。"表達(dá)載體"是可W引導(dǎo)所選擇的多核巧酸的表達(dá)的一類載體。
[0043] 如果調(diào)控序列影響核巧酸序列的表達(dá)(例如，表達(dá)的水平、時間或位置），那么核巧 酸序列與調(diào)控序列"可操作連接"。"調(diào)控序列"是影響其所可操作連接的核酸的表達(dá)(例如， 表達(dá)的水平、時間或位置）的核酸。調(diào)控序列可W，例如，直接對調(diào)控的核酸直接發(fā)揮其作 用，或通過一種或多種其他分子(例如，結(jié)合調(diào)控序列和/或核酸的多膚)發(fā)揮作用。調(diào)控序 列的實例包括啟動子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例如，多聚腺巧酸化信號）。調(diào)控序列的 其他實例在例如，Goeddel，1990，Gene Expr