?？捎糜谘苌?多膚的分子的實(shí)例包括白蛋白（例如，人血清白蛋白）和聚乙二醇(PEG)。多膚的白蛋白連接 的和PEG化的衍生物可W使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，將多膚綴合或W 其它方式連接于轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR)或TTR變體。TTR或TTR變體可W例如用選自由W下組 成的組的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾：右旋糖酢、聚(η-乙締基化咯燒酬）、聚乙二醇、聚丙二醇 均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙燒共聚物、聚氧乙締化多元醇和聚乙締醇（美國專利申請?zhí)?20030195154)。 巧…4] 組合物
[0105] 本發(fā)明還包括包含有效量的本發(fā)明的多膚產(chǎn)品（即，ΤΙΜΡ-3多膚、變體、突變蛋白 或衍生物)連同可藥用的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或ΤΙΜΡ-3療法中有用的 載體（即，其中提高內(nèi)源性ΤΙΜΡ-3水平或增加內(nèi)源性ΤΙΜΡ-3活性有用的條件）的藥物組合 物。此類組合物包括各種緩沖液內(nèi)容物(例如，Tris-肥1、醋酸鹽、憐酸鹽）、ρΗ值和離子強(qiáng)度 的稀釋劑;添加劑，諸如除垢劑和助溶劑(例如，Tween 80,聚山梨酸醋80)、抗氧化劑(例如， 抗壞血酸、焦亞硫酸鋼）、防腐劑(例如，硫柳隸、節(jié)醇)和增量物質(zhì)（例如，乳糖、甘露醇）；將 諸如聚乙二醇等聚合物共價(jià)連接到蛋白質(zhì)(如上述討論，參見，例如美國專利4，179,337，在 此W引用方式引入）；將所述材料并入聚合物(諸如聚乳酸、聚乙醇酸等)的顆粒制劑中或脂 質(zhì)體中。此類組合物會影響TIMP-3結(jié)合蛋白的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除 速率。參見，例如Remington's 陸armaceutical Sciences,第18版（1990，Mack Publishing Co. Jaston，Pa. 18042)第1435-1712頁，將其在此W引用方式并入本文。
[0106] -般來講，本發(fā)明多膚的有效量可通過受者的年齡、體重和疾病的狀態(tài)或嚴(yán)重程 度確定。參見，Remingtons Pharmaceutical Sciences，上述，第697-773頁，W 引用的方式 并入本文。通常，可W使用約O.OOlg/kg體重至約Ig/kg體重之間的劑量，但是有經(jīng)驗(yàn)的從業(yè) 者會認(rèn)識到，可W使用或多或少的劑量。對于局部（即，非全身性)應(yīng)用，如局部或關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng) 用，劑量可W在約O.OOlg/cm 2至約Ig/cm2之間。投藥可W是每天一次或多次，或更少，并且可 W與如本文所述的其他組合物一起。應(yīng)該注意本發(fā)明不限于本文中敘述的劑量。
[0107] 正如相關(guān)領(lǐng)域中所理解，W適合于適應(yīng)癥的方式對受試者施用包含本發(fā)明分子的 藥物組合物。藥物組合物可W通過任何合適的技術(shù)施用，包括但不限于腸胃外、局部 (topically)、局部（locally)或經(jīng)吸入。如果注射的話，則所述藥物組合物可W例如經(jīng)由靜 脈內(nèi)、肌內(nèi)、病灶內(nèi)、腹腔內(nèi)或皮下途徑，通過快速濃注或連續(xù)輸注來施用。
[0108] 涵蓋例如在疾病或損傷的位點(diǎn)處的局部施用，W及來自植入物的透皮遞送和緩 釋。其他替代方案包括眼藥水；日腔制劑，包括丸劑、糖漿、錠劑或日香糖；W及局部制劑，如 洗劑、凝膠、噴霧劑和軟膏。例如，對關(guān)節(jié)或肌肉骨胳系統(tǒng)的局部施用包括關(guān)節(jié)周圍、關(guān)節(jié) 內(nèi)、粘液囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、滑膜內(nèi)和腫內(nèi)施用。對呼吸系統(tǒng)施用包括肺內(nèi)、胸膜內(nèi) (intraplural)、肺內(nèi)、氣管內(nèi)、竇內(nèi)（intrasinal)和支氣管內(nèi)輸送，并且可W例如通過吸入 器或噴霧器來促進(jìn)。本文中還涵蓋銷內(nèi)輸送和對向腦部和/或神經(jīng)系統(tǒng)中引入組合物有用 的其他方法，例如，硬膜外、硬膜內(nèi)或硬膜周圍施用，W及神經(jīng)周圍、尾部內(nèi)、腦內(nèi)、腦池內(nèi)和 脊柱內(nèi)施用。
[0109] 局部施用的其他實(shí)例包括結(jié)合手術(shù)或另一種醫(yī)學(xué)操作對組織輸送。例如，在治療 或改善屯、臟癥狀的手術(shù)期間或在諸如屯、導(dǎo)管插入術(shù)(例如，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入)期間可W對 屯、臟組織施用藥物組合物。遞送可W是經(jīng)由例如冠狀動(dòng)脈內(nèi)、屯、內(nèi)、屯、肌內(nèi)和/或經(jīng)屯、內(nèi)膜 途徑，并且可W通過要注射的屯、臟區(qū)域的屯、內(nèi)或電動(dòng)機(jī)械圖像或通過使用其他技術(shù)(如磁 共振成象(MRI))指導(dǎo)。組合物還可W經(jīng)由包含于屯、臟補(bǔ)片中或于支架或?qū)ν汀⑴K病狀有用的 其他裝置的涂層中來遞送。
[0110] 除了滴眼劑之外，還涵蓋使用軟膏、乳膏或凝膠對眼睛施用本發(fā)明組合物。直接對 眼睛內(nèi)部施用可W通過眼周、結(jié)膜、角膜內(nèi)、結(jié)膜下、球筋膜下（subtenons)、眼球后、眼內(nèi) 和/或玻璃體內(nèi)注射或施用實(shí)現(xiàn)。運(yùn)些和其他技術(shù)例如在Gibaldi's Drug Delivery Systems in Pharmaceutical Care(2007,American Society of Health-System Pharmacists，Bethesda，MD)中有討論。
[0111] 為了保持胞外基質(zhì)和組織的動(dòng)態(tài)平衡，許多劑協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。在平衡偏離的病狀 的治療中，一種或多種其他劑可W與本發(fā)明多膚一起使用。運(yùn)些其他劑可W共同施用或堡 莖施用，或W其組合來施用。一般來講，運(yùn)些其他劑可W選自由金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、 基質(zhì)降解酶抑制劑、胞內(nèi)酶、細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)劑和調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)降解蛋白酶及其抑制劑的表 達(dá)的因子組成的列表。雖然下面列出特定的實(shí)例，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到完成等價(jià)功能 的其他劑，包括其他劑，或列出的劑的其他形式（如通過合成、經(jīng)由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的那 些、W及類似物和衍生物）。
[0112] 如果希望胞外基質(zhì)降解更高或更特異性的預(yù)防，還可W使用其他降解抑制劑。抑 審IJ劑可W選自由曰柜球蛋白、妊娠區(qū)帶蛋白、卵固蛋白、曰盛白酶抑制因子、曰浙血纖維蛋白 酶、抑蛋白酶膚、蛋白酶連接素-1、纖溶酶原激活因子抑制劑（PAI)-1、PAI-2、TIMP-1和 TIMP-2組成的組。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到可W使用其他的抑制劑。
[0113] 胞內(nèi)酶也可W與本發(fā)明多膚一起使用。胞內(nèi)酶還可W影響胞外基質(zhì)降解，并且包 括溶酶體酶、糖巧酶和組織蛋白酶。
[0114] 細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)劑也可W與本發(fā)明多膚組合使用。例如，人們可能在使用本發(fā)明多 膚抑制胞外基質(zhì)降解之前、期間或之后調(diào)節(jié)對胞外基質(zhì)的細(xì)胞粘附。對胞外基質(zhì)顯示細(xì)胞 粘附的細(xì)胞包括破骨細(xì)胞、巨隧細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、殺傷性T細(xì)胞和肥大細(xì) 胞。細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)劑包括含有"RG護(hù)基序或類似物或模擬物括抗劑或激動(dòng)劑的膚。
[011引調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)降解蛋白酶表達(dá)的因子及其抑制劑包括細(xì)胞因子，如IL-1和TNF-a、 TGF-β、糖皮質(zhì)激素和類視黃醇。如果希望的作用是使用本發(fā)明多膚抑制胞外基質(zhì)降解，連 同運(yùn)些細(xì)胞作用，也可W使用影響細(xì)胞增殖和/或分化的其他生長因子。例如，在炎癥期間， 人們可能希望維持胞外基質(zhì)(借助于抑制酶活性化希望產(chǎn)生嗜中性粒細(xì)胞；因此可w施用 G-CSF。其他因子包括促紅細(xì)胞生成素、白細(xì)胞介素家族成員、SCF、M-CSF、IGF-I、IGF-II、 EGF、FGF家族成員如KGF、PDGF及其他。人們此外可能希望干擾素的活性，如干擾素 α、β、丫或 復(fù)合干擾素的活性。細(xì)胞內(nèi)劑包括G-蛋白質(zhì)、蛋白激酶C和肌醇堿性憐酸酶。使用本發(fā)明多 膚可W與一種或多種設(shè)及炎癥療法的劑提供治療益處。
[0116] 還可W使用細(xì)胞運(yùn)輸劑。例如，炎癥設(shè)及胞外基質(zhì)的降解，W及細(xì)胞向損傷位置的 運(yùn)動(dòng)或運(yùn)輸。胞外基質(zhì)降解的預(yù)防可W防止運(yùn)些細(xì)胞運(yùn)輸。因此本發(fā)明多膚連同細(xì)胞運(yùn)輸 調(diào)節(jié)劑的激動(dòng)劑或括抗劑一起使用在治療炎癥中可能是希望的。細(xì)胞運(yùn)輸調(diào)節(jié)劑可W選自 由內(nèi)皮細(xì)胞表面受體(如Ε-選擇素和整聯(lián)蛋白）；白細(xì)胞表面受體化-選擇素）；趨化因子和 化學(xué)引誘劑組成。對于設(shè)及炎癥的組合物的綜述，參見化rlos等，Immunol.Rev.114:5-28 (1990)，將其W引用方式并入本文。 ^ ~
[0117] 此外，組合物可W包括neu分化因子（"NDF")，治療方法可W包括在施用TIMP-3之 前、同時(shí)或之后施用NDF。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NDF刺激TIMP-2的產(chǎn)生，并且NDF、TIMP-l、TIMP-2和/或 TIMP-3可W在治療腫瘤中提供益處。
[om]本發(fā)明的多膚產(chǎn)品可W通過與可檢測的標(biāo)記物質(zhì)（例如，用1叫放射性標(biāo)記，或用 巧光團(tuán)如Ale湖Fll的愧)[LifeTechnologies，Grand Island NY]標(biāo)記)締合"標(biāo)記'，從而提 供在固體組織和流體樣品（如血液或尿液）中TIMP-3的檢測和定量中有用的試劑。例如，本 發(fā)明的核酸產(chǎn)品還可W用可檢測標(biāo)記物(如放射性標(biāo)記和非同位素標(biāo)記，如生物素)標(biāo)記并 且在雜交過程中使用W鑒別相關(guān)基因。
[0119] 如上所述，本發(fā)明的TIMP-3多膚、變體突變蛋白或衍生物組合物在各種病癥中有 廣泛的應(yīng)用。因此，本文中涵蓋的另一個(gè)實(shí)施方案是包括本發(fā)明組合物和任選一種或多種 上述用于治療設(shè)及胞外基質(zhì)降解的病癥的其他組合物的試劑盒。又一個(gè)實(shí)施方案是在所述 包裝材料內(nèi)包括包裝材料和藥劑的制品，其中所述藥劑包含本發(fā)明多膚、變體、突變蛋白或 衍生物并且其中所述包裝材料包括標(biāo)明TIMP-3治療用途的標(biāo)簽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 藥劑可W用于選自由W下組成的組的適應(yīng)癥:癌癥、炎癥、關(guān)節(jié)炎(包括骨關(guān)節(jié)炎等）、營養(yǎng) 不良性大瘤型表皮松解癥、牙周病、潰瘍、肺氣腫、骨病癥、硬皮病、創(chuàng)傷愈合、紅細(xì)胞缺陷、 整形組織再建、受精或胚胎植入調(diào)節(jié)和神經(jīng)細(xì)胞病癥。運(yùn)種制品可W任選包括其他組合物 或其他組合物的標(biāo)簽描述。
[0120] 提供W下實(shí)施例W用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案或特征并且不欲限制其范圍。
[0121] 實(shí)施例1:
[0122] 本實(shí)施例描述了用于測定產(chǎn)生的TIMP-3中的突變對在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá) 的作用（如果有的話）的方法。本實(shí)施例描述了一般的載體和宿主細(xì)胞系統(tǒng)，眾多載體和宿 主細(xì)胞系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知，本文中描述的，并且適于測定TIMP-3序列中的特定突變對重組 蛋白表達(dá)的作用(如果有的話）。
[0123] 一般來講，TIMP-3編碼DNA在常規(guī)條件下連接到表達(dá)載體中（即，TIMP-3編碼DNA可 操作連接到載體中的其他序列W便可表達(dá)），并且用所述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且表達(dá)重組蛋白W及例如通過蛋白質(zhì)印跡 或SDS = PAGE定性/半定量地評價(jià)量，或使用諸如化SA(R&D Systems,Minneapolis MN)或 ForteBio 〇別到狼.(Pall ForteBio Co;rp，Menlo Park，CA)等的測定更定量地評價(jià)。W運(yùn)種 方式，可W測定各種突變對哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)TIMP-3蛋白、突變蛋白或變體的能力的作用。 [0124]如果所發(fā)生的突變是向TIMP-3多膚中引入N-連接的糖基化位點(diǎn)，或增強(qiáng)天然糖基 化位點(diǎn)，那么可能希望評價(jià)糖基化的存在和/或程度。如先前所述轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞并且半定 量測量(例如蛋白質(zhì)印跡)可W用于測定N-連接的糖基化是否成功引入、部分引入或完全引 入。
[012引實(shí)施例2:
[0126] 本實(shí)施例描述了用于測定TIMP-3中的突變是否導(dǎo)致肝素獨(dú)立性提高的方法。如先 前所述轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且在存在或不存在肝素下培養(yǎng)。為了形成肝素依賴性程度的觀 念，可W添加不同量的肝素。隨后測定在各種條件下表達(dá)的TIMP-3蛋白、突變蛋白或變體的 量，并且作比較W確定特定突變是否對TIMP-3蛋白、突變蛋白或變體從胞外基質(zhì)釋放是否 需要肝素有任何作用，或者需要的量或肝素是否降低。
[0127] 實(shí)施例3:
[0128] 本實(shí)施例描述了其中MM巧舌性通過使用巧光法測量的MM巧審制測定;其他方法在本 領(lǐng)域是已知的。例如，在通過活化MMP亞型或亞型特定催化結(jié)構(gòu)域裂解澤滅的MMP亞型5-FAM/QXL 520巧光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)膚底物時(shí)巧光信號升高。對于若干不同的匪P來說， FRET膚可從例如411日3口6(3少的111〇111，〔4獲得。本文中使用的1'加口-3蛋白可^是天然1'加口-3或 TIMP-3突變蛋白、變體或衍生物;要檢測的蛋白稱為測試分子。
[0129] 對于MMP2活性測定，在37°C下用ImM 4-氨基苯基乙酸隸(ΑΡΜΑ，Anaspec，F(xiàn)remont， CA)活化人p;r〇-MMP2(Anaspec，Rremont，CA) 1小時(shí)，隨后在37°C下用供應(yīng)商提供的在測定緩 沖液中的MMP2敏感性5-FAM/Q)(L 520 FRET膚相對在黑色384孔Optiplate^erkinElmer， Waltham,ΜΑ)中的各種濃度的測試分子解育。解育2小時(shí)之后，在Envision多標(biāo)記微盤讀數(shù) 器(Perki址1111日1'，￥日11:11日1]1，]^)上在激發(fā)(49〇]11]1)和發(fā)射（52〇]11]1)下測定來自反應(yīng)板的巧光 信號。在Gra地Pad Prism 5.0(Gra地化d，San Diego，CA)中相對所測試的測試分子濃度繪 制相對巧光單位(RFU)的數(shù)據(jù)，從而估算半數(shù)最大抑制常數(shù)(I巧0)。
[0130] 對于MMP9活性測量結(jié)果，在37°C下在黑色384孔Optiplate(PerkinElmer， Waltham，MA)中用MMP9敏感性5-FAM/QXL520FRET膚和各種濃度的測試分子解育人MMP9催化 結(jié)構(gòu)域（Anaspec，F(xiàn)remont，CA)。解育2小時(shí)之后，在EnVi S ion多標(biāo)記微盤讀數(shù)器 化erki址Imer，￥日1地日111，嫩)上在激發(fā)(490皿)和發(fā)射（520皿)下測定巧光信號。在6腳911口曰(1 Pri sm 5.0 (GrapWad，San D i ego，CA)中相對所測試的測試分子濃度繪制相對巧光單位 (RFU)的數(shù)據(jù)，從而估算半數(shù)最大抑制常數(shù)(I巧0)。
[01引]對于MMP13活性，在測定緩沖液（20mM Tris，10mM CaCbaOuM ZnCl2,0.01%Brij 35(Ca化iochem/EMD，SanDiego，CA)pH7.5)中滴定測試分子并且添加到黑色聚苯乙締96 或384孔測定板（Griener Bio-One，Germany )中。在測定緩沖液中稀釋活性MMP 13 (Ca化iochem/EMD)并添加到測試分子滴定中且在室溫下在50化最終體積中解育10分鐘。可 選地，在37°C下用ΑΡΜΑ將pr〇-MMP-13(R&D Systems,Minneapolis，MN)活化2小時(shí)，并且在測 定中使用。制備巧光底物，如Mca-PLGkDpa-AR-N肥巧光MMP底物或Mca-KPLGkDpa-AR-NH2 巧光膚底物(R&D Systems)，并且添加到MMP-13酶AuTIMP-3/測試分子溶液中。在動(dòng)力學(xué)上 測定MMP-13活性，例如使用Molecular Devices巧光板讀數(shù)器(或同等物)進(jìn)行20分鐘。 [0132]所測試的分子的作用可W表示為MMP酶活性的預(yù)期最大TIMP-3抑制的百分比?？?選地，MMP抑制活性的定量評價(jià)可能是不需要的；更確切地，單個(gè)測試分子可W評價(jià)它們是 否抑制MMP。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，本文中列出的參數(shù)可W由常規(guī)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用改變。例如， 使用先前測試的TIMP-3和其他材料進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)，從而確定MMP或pro-MPP的合適濃度。類 似地，也可W確定底物的類型和合適的濃度。因此，例如，可W滴定MMP并且與先前測試批次 的MMP比較W優(yōu)化測定參數(shù)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W利用類似的測定評價(jià)各種TIMP-3突 變對TIMP-3突變蛋白或變體抑制其他MMP的能力的作用(如果有的話）。
[0133] 實(shí)施例4
[0134] 使用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，制備編碼眾多TIMP-3突變蛋白的核酸并且在哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中表達(dá)，基本上如先前所述。評價(jià)突變對編碼的TIMP-3突變蛋白的表達(dá)的作用。發(fā)生的 突變的列表包括：
[0135] G115T、N118D;K4W、K49S;K4W、K4W;K4W、T63E;K4W、Q80E;T63E、H78E;K4W、 T63E、H78E;T63E、H78E、Q80E;K45E、T63E、H78E、Q80E;T63E、H78D;T63E、T74E、H78E;T63E、 T74E、H78D;L51T、T74E、H78D;T74E、H78E、Q80E;T74E、H78D、Q80E;R43T、T74E、H78D、Q80E; R43E、T74E、H78D、Q80E;R43N、K45T;K45N、V47T;K49N、L51T;K65N、M67T;K75N、P77T;R43N、 K45T、K49N、L51T;K45N、V47T、K49N、L51T;R43N、K45T、T63E、T74E、H78E;K45N、V47T、T63E、 T74E、H78E;K49N、L51T、T63E、T74E、H78E;K4W、K49N、L51T、T63E;R43T、K49N、L51T、T74E、 H78D;R43N、K45T、T74E、H78E;K49N、L51T、T74E、H78E;R43N、K45T、K49N、L51T、T74E、H78E; Q32N、A34T;S38D、D39T;R43N、K45T;V47N、K49T;K49N、L51T;K50N、V52T;L51N、K53T;F57N; P56N、G58T;T63N、K65T;P56N、G58T、T63N、K65T;M67N、M69T;H78N、Q80T;T84N、A86T;K94N、 E96T;E96N、N98T;V97N、K99T;K99N、Q101T;T105N、R107T;D110N、K112T;E122N、W124T; R123N、D125T;Q126N;T128N;Q131N、K133T;R132N G134T;R138N、H140T;R138T;H140N、 G142T;K142T;K146N、K148T;T158N、K160T;T166N、M168T;M168N;G173T;HS179N、H181T; H181N、A183T;R186N、K188T;R196N、W198T;P200N、D202T;P201N、K203T;D202N;A208Y; A208V;K45S、F57N;K49S、F57N;K68S、F57N;K133S、F57N;K45S、K133S、F57N;和K49S、K68S、 F57N〇
[0136] 對所表達(dá)的突變蛋白進(jìn)行其他評價(jià)，并且如下所述。涵蓋其他突變蛋白，包括 K4犯、K50E、K53E、K99E、R186Q、K188Q;K49S、K50N/V52T、K53E、V97N/K99T、R186N/K188T; K50N/V52T、V97N/K99T、R186N/K188T;K4W、K53E、K188Q;K50N/V52T、R186N/K188T;K50N/ V52T、F57N、R186N/K188T;K45S、K50N/V52T、F57N、R186N/K188T;K50N/V52T、F57N、T63N/ K65T、R186N/K188T;K45S、K50N/V52T、F57N R186N/K188T;K45S、K49S、K50N/V52T、巧7N R1 86N/K1 88T;K49S、K50N/V52T、F57N、V97N/K99T、R186N/K188T;K45S、K50N/V52T、F57N、 V97N/K99T、R186N/K188T。運(yùn)些突變蛋白可W如本文所述制造和測試。
[0137] 實(shí)施例5:
[0138] 此表總結(jié)了用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的眾多TIMP-3突變蛋白獲得的表達(dá)和MMP抑 制結(jié)果。對于"哺乳動(dòng)物表達(dá)對比WT"，數(shù)據(jù)記錄為' + '，表示表達(dá)基本上與野生型（或天然） TIMP-3相同；' ++ '表示表達(dá)比用野生型TIMP-3觀察到的提高2-4倍，且' +++ '表示表達(dá)比野 生型TIMP-3提高4倍W上。在提及酶抑制的列中的標(biāo)識'---'表示運(yùn)些測試沒有進(jìn)行。說明 與觀察到的野生型TIMP-3表達(dá)相比的表達(dá)倍數(shù)升高的表達(dá)水平升高是定性地通過使用蛋 白質(zhì)印跡或SDS-PAGE考馬斯染色凝膠，或通過使用捕獲TIMP-3的抗TIMP-3抗體利用 ForteBio Octet愈讀數(shù)器測量的表達(dá)效價(jià)測量結(jié)果來確定(運(yùn)些抗體是公開可利用的，例 如購自 EMD Mill ipore，Bill erica，MA: AbCam 液，，Cambridge，MA;或 R&D Systems， Minneapolis，MN)。
[0139] 表1
[0140]
[0141]
[0142]
[0143] 運(yùn)些突變中的某些與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的野生型TIMP-3相比顯示表達(dá)提高： T63E、T74E、H78E;T63E、T74E、H78D;K65N、M67T;K45N、V47T、T63E、T74E、H78E;K49N、L51T、 T63E、T74E、H78E;K49N、L51T、T74E、H78E;K49N、L51T;K50N、V52T;L51N、K53T;T63N、K65T; K75N、P77T;H78N、Q80T;K94N、E96T;D110N、K112T;Q126N;R138T;G173T;F57N;P56N、G58T; P56N、G58T;T63N、K65T;K45SJ57N;K49SJ57N;K68SJ57N;K133S、F57N;K45S、K133S、F57N; 和K49S、K68S、巧7N。在運(yùn)些當(dāng)中，子集（F57N;P56N、G58T;P56N、G58T;T63N、K65T;K45S、 巧 7N;K49S、F57N;K68S、巧 7N;K133S、F57N;K45S、K133S、F57N;和K49S、K68S、F57N)表達(dá)水平 是用野生型TIMP-3觀察到的表達(dá)水平的四倍或四倍W上。
[0144] 對于一些突變蛋白和野生型TIMP-3(WT)在MMP活性結(jié)果上進(jìn)行了詳細(xì)比較;運(yùn)些 結(jié)果在下面顯示。
[0145] 表2
[0146]
[0147] 實(shí)施例6
[0148] 運(yùn)個(gè)實(shí)施例描述了通過激發(fā)巧光細(xì)胞分選器(FACS)分析評價(jià)TIMP-3蛋白結(jié)合 HTB-94TM細(xì)胞（購自American Type Culture Collection,Manassas,VA的軟骨細(xì)胞細(xì)胞 系）的能力。在37C，5%C02下的HTB-94培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清[FB引和2IBM L谷氨酷胺 的高葡萄糖DMEM)中培養(yǎng)HTB-94細(xì)胞。在染色之前將細(xì)胞W2.5X104個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度 接種在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)瓶中達(dá)6-12周，并且在經(jīng)由膜酶消化從瓶中除去之后每3-4天傳代一 次。在FACS染色之前大約16小時(shí)，將HTB-94細(xì)胞W100，000個(gè)細(xì)胞每孔接種在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng) 12孔板中的2ml體積HTB94培養(yǎng)基中并且在37C，5 % C02下解育。在染色之前細(xì)胞是80-90 % 融合的。
[0149] 大約16小時(shí)之后，通過抽吸從12孔板除去HTB94培養(yǎng)基并且每個(gè)孔施加1ml 4C染 色緩沖液(憐酸鹽緩沖鹽水[PBS]2%FBS 0.15%化化）。將細(xì)胞板在冰上解育化。抽吸染色 緩沖液并且添加在染色緩沖液中稀釋的80μg/ml的TIMP-3HIS-Myc標(biāo)記蛋白質(zhì)(天然TIMP-3 或TIMP-3變體），0.9ml/孔；向陰性對照孔中僅添加相同體積的緩沖液。將細(xì)胞板在冰上解 育30min，抽吸并且用1ml/孔染色緩沖液洗涂兩次。第二次洗涂之后抽吸緩沖液，添加在染 色緩沖液中稀釋到20ug/ml的小鼠抗pentaHIS AlexaFluor488綴合抗體（Qiagen， Valencia，CA)，0.9mV孔。平行地，向用已知結(jié)合劑TIMP3HIS-Myc(例如，K45S、巧7N，SEQ ID N