ession Technology:Methods in Enzylnology 185，Academic Press'San Diego,CA和Baron等，1995，Nucleic Acids Res.23:3605-06中 描述。
[0044] 天然存在的胞外蛋白質(zhì)通常包括"信號序列"，其引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入蛋白質(zhì)分泌的細(xì) 胞途徑并且不存在于成熟蛋白質(zhì)中。信號序列還可W稱為"信號膚"或"前導(dǎo)膚"，并且從胞 外蛋白質(zhì)酶裂解。已經(jīng)運(yùn)樣加工的蛋白質(zhì)（即，已經(jīng)除去信號序列)往往稱為"成熟"蛋白質(zhì)。 編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多膚的多核巧酸可W編碼天然存在的信號序列或異源信號序列，其 中眾多在本領(lǐng)域是已知的。
[0045] 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，根據(jù)本實(shí)施方案的重組蛋白質(zhì)或多膚可W在包括哺乳動(dòng) 物細(xì)胞系在內(nèi)的細(xì)胞系中表達(dá)。編碼特定蛋白質(zhì)的序列可用于轉(zhuǎn)化合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì) 胞?？赏ㄟ^將多核巧酸引入宿主細(xì)胞中的任何已知方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，包括例如將多核巧酸包 裝在病毒中（或包裝在病毒載體中）并且用病毒(或載體)或通過本領(lǐng)域中已知的轉(zhuǎn)染操作 轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，如美國專利號4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455所例示(所述 專利在此W引用的方式并入本文）。所用轉(zhuǎn)化操作取決于有待轉(zhuǎn)化的宿主。用于將異源多核 巧酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的并且包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、憐酸 巧沉淀、凝聚胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將聚核巧酸囊封于脂質(zhì)體中W及將DNA 直接顯微注射于核中。
[0046] "宿主細(xì)胞"是可W用于表達(dá)核酸(例如，本發(fā)明的核酸）的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可W是 原核生物，例如，大腸桿菌，或者可W是真核生物，例如，單細(xì)胞真核生物(例如，酵母菌或其 他真菌），植物細(xì)胞(例如，煙草或番茄植物細(xì)胞），動(dòng)物細(xì)胞(例如，人細(xì)胞，猴細(xì)胞、倉鼠細(xì) 胞、大鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)或雜交瘤。宿主細(xì)胞的實(shí)例包括猴腎臟細(xì)胞的C0S-7系 (ATCC C化 1651)(參見Gluzman等，1981，Cell 23:175)、L細(xì)胞、C127細(xì)胞、3T3細(xì)胞(ATCC (XL 163)、中國倉鼠卵巢(C冊)細(xì)胞或其衍生細(xì)胞，如Veggie C冊和在無血清培養(yǎng)基中生長 的相關(guān)細(xì)胞系（參見3曰3111113 36]1等，1998，切1:〇16證]1〇1〇旨7 28:31)或缺乏0冊1?的邸0株0乂-B11 (參見 Urlaub 等，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20)、HeLa 細(xì)胞、B皿（ATCC 邸L 10)細(xì)胞系、衍生自非洲青猴腎臟細(xì)胞系CVl的CVl/EBNA細(xì)胞系(ATCC (XL 70)(參見 1。]?曰}1311等，1991，6]\?0 1.10:2821)、人胚腎細(xì)胞如293、293邸魁或151? 293、人表皮4431細(xì) 胞、人C〇1〇205細(xì)胞、其他轉(zhuǎn)化的靈長類動(dòng)物細(xì)胞系、正常二倍體細(xì)胞、衍生自初生組織離體 培養(yǎng)的細(xì)胞株、初級外植體、化-60、U937、化K或Jurkat細(xì)胞。
[0047] 通常，宿主細(xì)胞是可W用編碼多膚的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞，其隨后可W在 宿主細(xì)胞中表達(dá)。在"瞬時(shí)轉(zhuǎn)染"中，通過一些本領(lǐng)域已知方法之一將核酸引入宿主細(xì)胞，并 且重組蛋白質(zhì)表達(dá)有限的一段時(shí)間，通常最多約四天，在核酸消失或降解之前，例如，在宿 主細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂時(shí)。如果希望"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染"，就可W將編碼多膚的核酸連同編碼選擇性 標(biāo)記物的核酸一起引入宿主細(xì)胞。使用選擇性標(biāo)記物允許本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇轉(zhuǎn)染的宿主 細(xì)胞，其中編碼多膚的核酸被W在通過有絲分裂保存編碼多膚的核酸的方式整合到宿主細(xì) 胞基因組中，并且可W通過后代細(xì)胞表達(dá)。
[0048] 短語"重組宿主細(xì)胞"可W用于指示已經(jīng)用要表達(dá)的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。 宿主細(xì)胞還可W是包含所述核酸但是不在希望的水平表達(dá)所述核酸的細(xì)胞，除非向所述宿 主細(xì)胞引入調(diào)控序列W使其與所述核酸可操作連接。應(yīng)理解術(shù)語宿主細(xì)胞不僅是指具體的 主題細(xì)胞，而且是指運(yùn)種細(xì)胞的子代或潛在子代。因?yàn)槟承┬揎椏蒞由于例如突變或環(huán)境 影響而在下一代中出現(xiàn)，所W此類后代可能實(shí)際上與親代細(xì)胞不相同，但仍然包括在如本 文中所用的術(shù)語的范疇內(nèi)。
[0049] 本文使用的叮IMP-3DNA"、叮IMP-3-編碼DNA"等指示選擇的TIMP-3編碼核酸，其中 由此表達(dá)的TIMP-3可W是天然TIMP-3或如本文所述的TIMP-3變體或突變蛋白。同樣地， 叮IMP-3"、叮IMP-3蛋白質(zhì)"和叮IMP-3多膚"用于表示天然TIMP-3蛋白或包含一個(gè)或多個(gè)突 變的TIMP-3蛋白（即，TIMP-3多膚、變體、衍生物或突變蛋白）dTIMP-3的特定的突變蛋白可 W通過突變表示，例如/'K45N TIMP-3"或"K45N TIMP-3多膚"表示其中天然TIMP-3的氨基 酸45位處的賴氨酸化)已被天口冬酷胺(N)置換的多膚。
[0050] 本文使用的術(shù)語"天然TIMP-3"是指野生型TIMP-3dTIMP-3由哺乳動(dòng)物中的各種細(xì) 胞或組織表達(dá)并且存在于胞外基質(zhì)中；運(yùn)樣表達(dá)的TIMP-3在本文中還稱為"內(nèi)源性"TIMP-3dTIMP-3的氨基酸序列和編碼TIMP-3的DNA的核酸序列在2003年5月13日頒發(fā)的美國專利 6,562,596中公開，所述專利的公開內(nèi)容W引用的方式并入本文。美國專利6,562,596中使 用的氨基酸編號系統(tǒng)用負(fù)數(shù)表示信號(或前導(dǎo))膚中的氨基酸，并且將成熟蛋白質(zhì)（即，已經(jīng) 除去信號膚或前導(dǎo)膚的蛋白質(zhì))稱為氨基酸1-188。本文中使用的編號系統(tǒng)用表示為#1的天 然前導(dǎo)膚的第一個(gè)氨基酸指示TIMP-3;因此全長TIMP-3包括氨基酸1-211，并且成熟形式是 氨基酸24-211。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解使用運(yùn)些不同編號系統(tǒng)可能出現(xiàn)氨基酸編號中的 差異，并且因此可W容易地對例如成熟形式的第一個(gè)氨基酸被稱為#1的TIMP-3多膚應(yīng)用本 文中使用的編號系統(tǒng)。因此，例如，本文中表示的K45州尋為使用美國專利6,562,596的編號 系統(tǒng)表示的K22N。
[0051] TIMP-3由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域形成，包含TIMP-3的氨基酸24至143的N末端結(jié)構(gòu)域(即，約Ξ 分之二的所述分子)和包含氨基酸144至211的C末端結(jié)構(gòu)域。圖3呈現(xiàn)TIMP-3的2維多膚陣 列，突出顯示促進(jìn)二級和Ξ級結(jié)構(gòu)TIMP-3形成的二硫鍵的絡(luò)合性質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TIMP-3的N末 端結(jié)構(gòu)域(常稱為"N-TIMP-3")顯示至少一些TIMP-3的生物活性；因此，如本文所述的TIMP-3變體、衍生物和突變蛋白包括含有N末端結(jié)構(gòu)域的TIMP-3片段的變體、衍生物和突變蛋白。
[0052] 天然TIMP-3蛋白作為治療分子使用有一些挑戰(zhàn)。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物表達(dá)技 術(shù)的TIMP-3蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)效價(jià)太低W致不允許足夠量的TIMP-3在適合于治療蛋白 質(zhì)的規(guī)模上產(chǎn)生。此外，TIMP-3與胞外基質(zhì)的結(jié)合使在細(xì)胞培養(yǎng)基中包含肝素成為必需(或 減少TIMP-3與胞外基質(zhì)結(jié)合的相似劑），并且與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白l(LRPl)清除蛋 白質(zhì)結(jié)合加劇重組TIMP-3W允許待開發(fā)的生產(chǎn)規(guī)模工藝的水平向介質(zhì)中分泌的挑戰(zhàn)。已經(jīng) 證明全長TIMP-3在原核細(xì)胞中的微生物生產(chǎn)是困難的，運(yùn)是由于蛋白質(zhì)的不正確折疊。
[0053] 因此，為了克服一個(gè)或多個(gè)運(yùn)些挑戰(zhàn)，本發(fā)明的TIMP-3變體或突變蛋白已經(jīng)被修 飾。本發(fā)明的多膚包括已經(jīng)W任何方式W及任何原因進(jìn)行修飾的多膚，例如，從而：（1)降低 對蛋白質(zhì)水解的敏感度，（2)降低對氧化的敏感度，（3)降低對抑制TIMP-3與細(xì)胞培養(yǎng)中的 胞外基質(zhì)結(jié)合的劑的需要，（4)改變其他部分的結(jié)合親和力，例如清除受體如LRP-1，（5)帶 來或改變其他物理化學(xué)或功能性質(zhì)，包括藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)，（6)促進(jìn)重組蛋白質(zhì)的表達(dá) 和/或純化。類似物包括多膚的突變蛋白。例如，單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換(例如保守氨基酸置 換)可W在天然存在的序列中進(jìn)行(例如，在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外部的多膚部分中進(jìn) 行）。共有序列可W用于選擇用于置換的氨基酸殘基;本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到其他氨基酸殘 基也可W被置換。
[0054] 在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供顯示突變蛋白或變體的表達(dá)水平比用天然TIMP-3觀 察的突變蛋白或變體的表達(dá)水平升高的TIMP-3突變蛋白或變體;在本發(fā)明的另一個(gè)方面 中，升高的表達(dá)出現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中。表達(dá)水平可W通過允許定量或半定量分 析細(xì)胞培養(yǎng)上清液（即，條件培養(yǎng)基(CM))中的重組TIMP-3(天然、變體或突變蛋白）的量的 任何合適的方法測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過蛋白質(zhì)印跡評價(jià)樣品或CM;在另一個(gè)實(shí)施方 案中，使用標(biāo)準(zhǔn)人TIMP-3化ISA評價(jià)CM樣品。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中觀察到表達(dá)升高;在另一個(gè)實(shí)施方案中，在 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中觀察到表達(dá)升高。一個(gè)實(shí)施方案提供觀察到的表達(dá)升高比天然TIMP-3觀察 到的大兩倍(2x)的TIMP-3突變蛋白或變體;另一個(gè)實(shí)施方案提供觀察到的表達(dá)升高比天然 TIMP-3觀察到的大五倍(5x)的TIMP-3突變蛋白或變體。其他實(shí)施方案包括表達(dá)升高Ξ倍 (3x)、四倍(4x)或六倍(6x)的TIMP-3突變蛋白或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，TIMP-3突變蛋白 或變體的表達(dá)比天然TIMP-3觀察到的大十倍（lOx);在另一個(gè)實(shí)施方案中，觀察到的表達(dá)比 天然TIMP-3觀察到的大十倍W上，例如，大20倍(20x)或更高
[0056] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了顯示對向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加肝素(或抑制TIMP-3與胞外基質(zhì)結(jié)合的另一種劑)的要求降低的TIMP-3突變蛋白（或變體）。肝素(或其他劑)的 量的降低可W用半定量的方式描述，即，降低可W是部分、中等、相當(dāng)大或徹底的。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，降低表達(dá)為百分比，例如肝素(或相似的劑）的量可W降低10%、20%、30%、 40%、50%或更多(例如60%、70%、80%、90%或100%)。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含插入的糖基化位點(diǎn)的TIMP-3變體突變蛋白。正如本 領(lǐng)域所知，糖基化類型可W取決于蛋白質(zhì)的序列（例如，存在或不存在特定的糖基化氨基酸 殘基，在下面討論)或產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞或有機(jī)體兩者。下面討論特定的表達(dá)系統(tǒng)。糖 基化的存在、不存在或程度可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法測定，包括通過蛋白 質(zhì)印跡或考馬斯染色SDS-PAGE凝膠觀察到的分子量(MW)中的位移的半定性測量，而定量測 量可W包括使用質(zhì)譜分光光度計(jì)技術(shù)W及觀察對應(yīng)于天口冬酷胺連接的糖基化增加的mw 變化，或觀察天口冬酷胺連接的糖基化被諸如膚-N-糖巧酶F(PNGase-F;SigmaAldrich， St丄ouis，M0)等酶除去的質(zhì)量變化。
[0058] 多膚的糖基化通常是N-連接或鄰-連接的。N-連接是指碳水化合物部分與天口冬 酷胺殘基的側(cè)鏈連接。Ξ膚序列天口冬酷胺-X-絲氨酸(N X S)和天口冬酷胺-X-蘇氨酸(N X T)，其中X是脯氨酸除外的任何氨基酸，是碳水化合物部分與天口冬酷胺側(cè)鏈酶連接的識 別序列。因此，在多膚中存在運(yùn)些Ξ膚序列的任何一個(gè)產(chǎn)生一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。0-連接 的糖基化是指糖N-乙酷半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與徑氨基酸連接，最常見的是絲氨酸 或蘇氨酸，不過也可W使用5-徑基脯氨酸或5-徑基賴氨酸。
[0059] 向抗原結(jié)合蛋白添加糖基化位點(diǎn)可通過改變氨基酸序列W使其含有一個(gè)或多個(gè) 上述Ξ膚序列來方便地實(shí)現(xiàn)(對于N-連接的糖基化位點(diǎn)）。變化也可W通過向起始序列添加 或置換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來實(shí)現(xiàn)(對于0-連接的糖基化位點(diǎn)）。為了簡便，蛋 白質(zhì)氨基酸序列優(yōu)選通過DNA水平的變化來改變，特別是通過使編碼祀多膚的DNA在預(yù)選的 堿基處突變從而產(chǎn)生將翻譯成希望的氨基酸的密碼子。
[0060] 因此，可W通過改變單個(gè)氨基酸的密碼子添加 N-連接的糖基化位點(diǎn)。例如，編碼N-X-Z的密碼子(其中Z是任何氨基酸)可W被改變成編碼N-X-T(或N-X-S)，或編碼y-X-iyS的 密碼子可W被改變成編碼N-X-T/S?；蛘撸幋a兩個(gè)氨基酸的密碼子可W被同時(shí)改變成引入 N-連接的糖基化位點(diǎn)（例如，y-X-z的密碼子可W被改變成編碼N-X-T/S)。W運(yùn)種方式，可W 插入一到十個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)。
[0061] 除了向TIMP-3中插入N-連接的糖基化位點(diǎn)之外，可W改變存在于天然TIMP-3中的 任何糖基化位點(diǎn)，例如在努力穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)的過程中。因此，例如，在殘基208處的A可W被 不同殘基置換，如Y、V或G。在殘基206-208的'N-X-T'位點(diǎn)處的其他改變包括用F置換在殘基 205處的I，或用Y置換在殘基205處的I，W及在殘基208處的上述置換之一。
[0062] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，鑒別對蛋白水解裂解敏感的區(qū)域并且使其突變。在本發(fā)明 的另一個(gè)方面中，提供顯示與清除受體LRP-1相互作用降低的TIMP-3突變蛋白或變體。在一 個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)種突變蛋白是通過鑒別假設(shè)在TIMP-3與LRP-1之間的相互作用中重要的 賴氨酸殘基并且使其突變而得到。
[0063] 此外，認(rèn)為TIMP-3突變蛋白或變體可W顯示一種W上運(yùn)些性質(zhì)（例如，插入的糖基 化位點(diǎn)可W降低細(xì)胞培養(yǎng)基中對肝素的需要，降低與LRP-1的相互作用W及提高對蛋白質(zhì) 水解的抗性）。其他實(shí)施方案包括具有一個(gè)W上突變的TIMP-3突變蛋白或變體，從而使突變 的組合產(chǎn)生一種W上上述性質(zhì)或作用。
[0064] 可W用一些方式來鑒別希望的TIMP-3突變蛋白。在第一個(gè)方法中，使用模擬實(shí)驗(yàn) 來促進(jìn)TIMP-3和相關(guān)的金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2之間的電荷再平衡舊經(jīng)觀察到后者顯示 優(yōu)良的哺乳動(dòng)物表達(dá)譜）。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，TIMP-3表面暴露的帶正電膜片重新 分布W模擬TIMP-2帶電表面。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TIMP-2和TIMP-3之間的電荷差被糖基 化位點(diǎn)的插入掩蓋。糖基化插入也可W用于表達(dá)改善（參見，例如，Enhancing the Secretion of Recombinant Proteins by Engineering N-Glycosylation Sites.LiuY. 等，Amer Inst Qiem Eng 2009，1468頁）。
[0065] 因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，篩選了通過計(jì)算分析開發(fā)的溶劑暴露位點(diǎn)的亞集合 的N-糖基化可能性。對于設(shè)及糖基化位點(diǎn)插入的方法，N-糖基化預(yù)測工具在選擇可W發(fā)生 突變W促進(jìn)潛在的N-連接的糖基化中是有用的，例如通過鑒別可W發(fā)生突變W形成典型的 N-X-T糖基化位點(diǎn)的殘基(其中N是天口冬酷胺，X是任何氨基酸并且T是蘇氨酸）。在又一個(gè) 實(shí)施方案中，使用基于結(jié)構(gòu)的方法鑒別所有溶劑暴露的氨基酸(包括具有側(cè)鏈暴露>20Λ 2 的那些氨基酸）。又一個(gè)實(shí)施方案包括在TIMP-3上的LRP1相互作用賴氨酸的突變，基于 LRP1/RAP(受體相關(guān)蛋白質(zhì)）的晶體結(jié)構(gòu)(其中相互作用的RAP賴氨酸相對TIMP-3定位）。
[0066] 本文中涵蓋其他組合。例如，F(xiàn)57N突變可W連同在賴氨酸殘基處的突變一起完成， 其中所述賴氨酸殘基是TIMP-3中的任何賴氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)賴氨酸發(fā)生突變； 在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)、Ξ個(gè)、四個(gè)或五個(gè)賴氨酸殘基發(fā)生突變。在某些實(shí)施方案中，在 氨基酸45和/或133的賴氨酸殘基可W發(fā)生突變。在另一個(gè)實(shí)例中，F(xiàn)57N突變引入單個(gè)N-連 接的糖基化位點(diǎn)；運(yùn)種突變可W與其他突變一起完成從而引入其他糖基化位點(diǎn)，或和設(shè)計(jì) 成能影響一種或多種TIMP-3的上述性質(zhì)的其他突變。本文中涵蓋包括一個(gè)引入的N-連接的 糖基化位點(diǎn)、包括兩個(gè)、Ξ個(gè)或四個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)W及包括五個(gè)或更多N-連接的糖 基化位點(diǎn)的TIMP-3突變蛋白或變體。
[0067] 特定的突變在圖1和2中展示。圖1呈現(xiàn)天然的全長人TIMP-3和突變形式的全長人 TIMP-3的比對，其中字母?'已被置換為所述序列內(nèi)的具體氨基酸。信號序列加 W下劃線； 因此其他信號序列可W被置換，如本文所述。設(shè)想在TIMP-3的成熟形式中的某些置換，并且 在本文中表示為"n#m"，其中V'表示天然的全長TIMP-3中發(fā)現(xiàn)的氨基酸，表示氨基酸殘 基數(shù)目，且V表示已被置換的氨基酸。因此，例如，"K45N"指示在氨基酸45處的賴氨酸化） 已被天口冬酷胺(N)置換。本文中示例的突變形式的人TIMP-3包括W下突變(單獨(dú)或組合）： K45N；K45S；V47T；K50N；V52T；P56N；F57N；G58T；T63E；T63N；K65T；T74E；H78E；H78E；H78N； Q80T;K94N;E96T;D110N;K112T;Q126N;R138T 和 G173T。還涵蓋運(yùn)些突變的組合，并且可 W 包 括兩到十個(gè)(即，2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))上述置換。
[006引 突變的特定組合包括K4祀、K49S; K4祀、K4犯；K4祀、T63E; K4祀、Q80E; K4祀、T63E、 H78E;T63E、H78E、Q80E;K45E、T63E、H78E、Q80E;L51T、T74E、H78D;T74E、H78E、Q80E;T74E、 H78D、Q80E;K45N、V47T;K49N、L51T;K75N、P77T;K45E、K49N、L51T、T63E;E96N、N98T;V97N、 K99T;R138N、H140T;T158N、K160T;T166N、M168T;H181N、A183T;R186N、K188T;P201N、K203T; A208Y;A208V;T63E、T74E、H78E;T63E、T74E、H78D;K65N、M67T;K45N、V47T、T63E、T74E、H78E; K49N、L51T、T63E、T74E、H78E;K49N、L51T、T74E、H78E;K49N、L51T;K50N、V52T;L51N、K53T; T63N、K65T;H78N、Q80T;K94N、E96T;D110N、K112T;Q126N;R138T;G173T;F57N;P56N、G58T; P56N、G58T;T63N、K65T;K45SJ57N;K49SJ57N;K68SJ57N;K133S、F57N;K45S、K133S、F57N; 和K49S、K68S、巧7N。
[0069] 其他組合包括 K45S、F57N、D110N、K112T;K45S、F57N、H78N、Q80T、D110N、K112T; K45S、F57N、H78N、Q80T、D110N、K112T、Q126N;K45S、F57N、H78N、Q80T、K94N、E96T Q126N; K45S、F57N、H78N、Q80T、Q126N、G173T;K45S、F57N、T63N、K65T;K45SJ57N、T63N、K65T、K94N、 E96T;K45S、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、G173T;K45S、F57N、T63N、K65T、R138T、G173T; K45N、V47T、F57N、T63N、K65T、R138T、G173T;K45S、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、R138T; K45N、V47T、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、R138T;K45S、F57N、Q126N、R138T、G173T;P56N、 G58T、T63N、K65T、K94N、E96T、Q126N、G173T;P56N、G58T、T63N、K65T、D110N、K112T、Q126N、 G173T;和K45S、F57N、Q126N、R138T、G173T。
[0070] 其他突變包括 K49S、K50N/V52T、K53E、V97N/K99T、R186N/K188T;K50N/V52T、V97N/ K99T、R186N/K188T;K4W、K53E、K188Q;K50N/V52T、R186N/K188T;K50N/V52TJ57N、R186N/ K188T;K45S、K50N/V52T、F57N、R186N/K188T;K50N/V52T、F57N、T63N/K65T、RI 86N/K188T; K45S、K50N/V52T、F57N R186N/K188T;K45S、K49S、K50N/V52T、F57N R186N/K188T;K49S、 K50N/V52T、F57N、V97N/K99T、R186N/K188T;和K45S、K50N/V52T、F57N、V97N/K99T、R186N/ K188T。
[0071] 圖2呈現(xiàn)天然的全長人TIMP-3和其中已經(jīng)完成使所述序列變得更相似于TIMP-2的 序列的某些氨基酸置換的TIMP-3變體。呈現(xiàn)信號序列并且對于天然的全長TIMP-3序列加 W 下劃線W保持編號的一致性，其他信號序列可因此被置換，如本文所述。在TIMP-3變體的序 列中，"X"已被置換為特定的氨基酸W指明設(shè)想有置換的成熟形式的TIMP-3中的殘基。運(yùn)些 置換包括在殘基25處的H、K、P、R、S或W;在殘基27處的A、在殘基28處的D、L或S;在殘基32處 的N;在殘基39處的T;在殘基43處的T、F、A或N;在殘基45處的I或T;在殘基46處的D;在殘基 48處的S;在殘基49處的S;在殘基51處的T;在殘基63處的N;在殘基67處的N;在殘基68處的 I;在殘基78處的D或W;在殘基96處的T;在殘基202處的N和在殘基207處的S。置換可W是單 獨(dú)或組合進(jìn)行的。因此，使用對于圖1描述的編排格式，圖2中示例的一個(gè)變體是A27T、I68K。 還涵蓋其他組合，并且可W包括兩到十個(gè)上述置換。此外，圖2中描述的置換可W與圖1中描 述的置換組合，例如，A27T、P56N、G58T。
[0072] Lee等〇.81〇1.化6111.282:6887;2007)公開了聲稱鑒別1'1]\^-3中的胞外基質(zhì)結(jié)合 基序的研究。當(dāng)他們未能鑒別TIMP-3中的已知肝素結(jié)合序列時(shí)，他們鑒別了十一個(gè)賴氨酸 和精氨酸殘基，其位置表明運(yùn)些堿性氨基酸的側(cè)鏈會(huì)W相當(dāng)高的密度暴露在TIMP-3的表 面。運(yùn)些殘基是 1(26、1(27、1(30、1(71、1(76、1?100、1(123、1(125、1(137、1?163、1(165(使用本文中使用 的編號系統(tǒng)，運(yùn)些殘基編號將是K49、K50、K53、K94、K99、R123、K146、K148、K160、R186、 K188)。因此，其他TIMP-3突變蛋白包括下面顯示的那些。運(yùn)些突變蛋白預(yù)期顯示部分或全 部肝素獨(dú)立性。除了改變表面暴露的堿性氨基酸側(cè)鏈之外。某些突變還會(huì)向TIMP-3突變蛋 白（即，K94N/E96T)中引入N-連接的糖基化位點(diǎn)。
[0073] 在被降低肝素獨(dú)立性的突變蛋白當(dāng)中是K4犯、K50E、K53E、K9犯、R186Q、K188Q; K4 犯、K50E、K53E、F57N、KWE、R186Q、K188Q;K45S、K50E、K53E、F57N、K99E、R186Q、K188Q; K49S、K50N/V52T、K99E、K188Q;K50N/V52T、K99E、K188Q;K50N/V52T、K94N/E96T、K188Q; K50N/V52T、K94N/E96T、G173T;K50N/V52T、R186N/K188T;K50N/V52T、K94N/E96T、R186N、 K188T;K50N/V52T、F57N、K94N/E96T、R186N/K188T;K45S、K50N/V52T、F57N、K94N/E96T、 R186N/K188T;K50N/V52T、T63N/K65T、K94N/E96T、R186N/K188T;K45S、K50N/V52T、T63N/ K65T、K94