，打開凍干管菌種，其中凍干管菌種包括：雙歧桿菌（菌號： CGTMCC-1.2212，中國普通微生物菌種保藏管理中心）， 短雙歧桿菌(菌號:CGTMCC- 1.2213，中國普通微生物菌種保藏管理中心），嬰兒雙岐桿 菌（菌號：CGTMCC -1.2202，中國普通微生物菌種保藏管理中心），鼠李糖乳桿菌（菌號： CICC一6065，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心），將所述的4株菌種內(nèi)分別加入以上滅菌 的試管培養(yǎng)基lml，搖動溶化后得到凍干管菌懸液備用，再將所述的4支凍干管菌懸液分別 各取lml加入至4支試管培養(yǎng)基中進行密封后放搖瓶機搖動制得擴大菌種液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特征在 于，所述的一級種子培養(yǎng)基培養(yǎng)中各組分為： 核桃仁20克、花生仁20克、酪蛋白酸鈉10克、L一精氨酸5克、番茄粉6克、牛肉膏8克、酵 母浸粉3克、蛋白胨3克、檸檬酸胺0.15克、絲氨酸0.8克、葡萄糖酸0.4克、氯化鈉3克、乳糖10 克、葡萄糖15克、乙酸鈉6克、無水氯化鈣0.1克、磷酸氫二鉀2克、50萬單位脂肪酶10克、10萬 單位無花果酶10克、自來水1000毫升，PH自然； 將所述一級種子培養(yǎng)基中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶、無水氯化鈣加入所述600毫 升的水中進行研磨至漿狀，過濾后得到漿液，然后再所得漿液中加入400毫升水并加熱到53 °C~57°C并進行攪拌，在攪拌下加入脂肪酶進行酶解，酶解后再加入無花果酶進行酶解得到 酶解液，然后向酶解液中加入其他原料，進行攪拌熔化得到一級種子培養(yǎng)液； 將所述的一級種子培養(yǎng)液量取所用量加入到三角瓶中封口后滅菌，將裝有經(jīng)過滅菌的 培養(yǎng)液的三角瓶放超凈工作臺中降溫，當(dāng)溫度降到31°C~37°C，在無菌條件下將所述培養(yǎng)好 的擴大菌種液接到三角瓶中，即l〇〇ml-級種子培養(yǎng)液接入的擴大菌種液為4ml，完畢后放 搖瓶機中，得到一級菌種液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特征在 于，所述的種子罐培養(yǎng)包括以下步驟： 將種子罐及發(fā)酵罐進行空罐滅菌處理； 其中種子罐培養(yǎng)基中各組分的重量比為： 核桃仁1.5%、花生仁1.5%、酪蛋白酸鈉0.2%、L一精氨酸0.3%、番茄粉0.2%、牛肉膏 〇. 4%、蛋白胨0.2%、丁酸鈣0.5%、檸檬酸胺0.02%、絲氨酸0.04%、葡萄糖酸0.5%、氯化鈉0.3%、 乳糖0.5%、葡萄糖1%、乙酸鈉0.3%、無水氯化鈣0.03%、可溶性淀粉0.3%、50萬單位脂肪酶1%、 10萬單位無花果酶1%、磷酸氫二鉀0.2%、聚醚消泡劑0.01%、自來水90%，PH自然； 將所述的種子罐培養(yǎng)基配方中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸鈉、無水氯化鈣加入20公斤 的水中進行研磨至漿狀，過濾后得到漿液，然后將漿液加熱到53°C~57°C進行攪拌，在攪拌 中加入脂肪酶進行酶解，再加入無花果酶進行酶解得到酶解液，將所述的酶解液、剩余量的 水和原料不分先后順序的投入種子罐并進行攪拌，然后經(jīng)過高溫滅菌及降溫處理后，將所 述培養(yǎng)好的一級菌種液在無菌條件下接種到經(jīng)滅菌處理的種子罐中，接種量分別是罐內(nèi) 種子培養(yǎng)基的2%，然后蓋好罐上的接種帽，通過無菌通風(fēng)培養(yǎng)制得種子罐菌種液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特征在 于，所述的發(fā)酵液制備包括以下步驟： 將發(fā)酵設(shè)備的管道、無菌空氣過濾系統(tǒng)進行滅菌處理； 發(fā)酵罐培養(yǎng)： 種子罐培養(yǎng)基配方中各組分的重量百分比為： 核桃仁2.5%、花生仁2.5%、酪蛋白酸鈉0.3%、L一精氨酸0.3%、磷酸氫二鉀0.2%、番茄粉 0.2%、卷心菜粉0.1%、牛肉膏0.5%、酵母浸粉0.2%、蛋白胨1%、丁酸鈣0.5%、快速滲透劑T 0.2%、檸檬酸胺0.2%、絲氨酸0.1%、葡萄糖酸0.6%、氯化鈉0.3%、乳糖2%、葡萄糖2%、乙酸鈉 0.7%、可溶性淀粉0.2%、無水氯化鈣0.1%、50萬單位脂肪酶1%、10萬單位無花果酶1%、聚醚消 泡劑0 · 1%、自來水83 · 2%，PH自然； 制備發(fā)酵罐培養(yǎng)基:首先將所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方中的水投入到經(jīng)滅菌處理的發(fā)酵罐 中，然后開動攪拌機，向攪拌罐中加入核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶和無水氯化鈣進行攪拌 并過濾收集漿液，將漿液加熱至53°C ~57°C后在攪拌下加入脂肪酶進行酶解后再加入無花 果酶進行酶解得到酶解液，將所述的酶解液和余量的水投入至滅菌的發(fā)酵罐并加入余量的 原料進行攪拌，經(jīng)過高溫滅菌及降溫處理后，得到發(fā)酵罐培養(yǎng)基； 制備誘導(dǎo)液:將丁酸鈣、快速滲透劑T、乳糖放至20kg中的自來水中進行攪拌溶化后得 到誘導(dǎo)液； 接種:通過差壓法將種子罐菌種送至發(fā)酵罐中，將所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基接入種子罐菌中， 其中接種量是每l〇〇kg發(fā)酵罐培養(yǎng)基接入種子罐菌種8kg，并在接種過程中加入誘導(dǎo)液進行 誘導(dǎo)，得到發(fā)酵液； 收集濕菌泥:開動管式離心機，調(diào)整轉(zhuǎn)速8000轉(zhuǎn)/分鐘，以每分鐘進料20公斤的進料速 度進行例行，棄上清，收集濕菌泥，然后進行二次離心，轉(zhuǎn)速為13000/分鐘，棄上清，收集濕 菌泥。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特征在 于，其中所述擴大菌種液是在31_37°C的溫度下，采用150-210轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，在搖瓶機中 搖動24~30小時制得。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特征在 于，其中所述一級菌種液是在31-37°C的溫度下，采用搖瓶機在150-210轉(zhuǎn)/每分鐘的轉(zhuǎn)速 下，搖動12 -28小時制得。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特征在 于，其中所述通過無菌通風(fēng)培養(yǎng)制得種子罐菌種液的過程中，無菌空氣用量為每100公斤種 子培養(yǎng)基每分鐘用無菌空氣0.05立方，PH值自然，攪拌速度80-180轉(zhuǎn)/每分鐘，罐壓0.05兆 帕，溫度31 _37°C，培養(yǎng)時間20~24小時。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特征在 于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:溫度31-37°C、80-140轉(zhuǎn)/每分鐘，通風(fēng)量每100公斤培 養(yǎng)液每分鐘通入氮氣0.1立方米，通入時間為3小時，PH值自然，發(fā)酵時間為30-40小時結(jié) 束。10. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特 征在于，所述的制備試管培養(yǎng)基過程中的酶解液和制備一級種子培養(yǎng)液過程中的酶解液的 制備是通過過濾后的漿液中加入50萬單位的脂肪酶10g酶解10~30分鐘，再加入10萬單位的 無花果酶l〇g酶解20~70分鐘得到。11. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特 征在于，所述的制備種子培養(yǎng)基過程中酶解液和制備發(fā)酵罐培養(yǎng)基過程中酶解液的制備是 通過過濾后漿液中加入50萬單位的脂肪1000g，酶解10~40分鐘，再加入10萬單位的無花果 酶1000g，酶解20~70分鐘得到。12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特征在 于，所述的步驟中還包括濕菌泥的冷凍干燥，其中冷凍干燥還包括懸菌液的制備和真空干 燥，其中懸菌液的制備包括取濕菌泥并加入無菌蒸餾水加熱至60~65°C，并攪拌并加入麥芽 糊精，溶化后再加入水、脫脂奶粉、乳糖、甘油，在30~40°C的條件下攪拌1~2小時，得到懸菌 液，然后將懸菌液放入恒溫室中恒溫60分鐘進行預(yù)凍； 其中真空干燥步驟為將預(yù)凍好的料盤放入真空干燥室進行抽真空干燥，并且干燥條件 為真空度為10~15pa，溫度為-50°C，干燥室溫度為32°C，干燥時間為55小時，凍干完畢后收 集凍干料。13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，其特征在 于，所述的混合發(fā)酵菌的形式包括囊劑、粉劑、片劑、膏劑、液體、奶制品，所述的粉劑包括用 無菌粉碎機將凍干料粉碎成細(xì)度為80目的粉菌;所述的囊劑的復(fù)配包括將凍干料粉碎成細(xì) 度為80目的菌粉10g，與代謝物干燥粉15g、微晶纖維素20g、硅膠粉20g、乳糖10g，硬脂酸鎂 15g、L-谷氨酰胺10g放入固體攪拌混合機中混合均勻，在無菌條件下分裝入膠囊;所述的膏 劑包括粉菌進行低溫濃縮后的膏狀物。14. 一種利用權(quán)利要求1~12的工藝制備的雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌的運用，其特征 在于，所述的雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌可以運用在農(nóng)作物的培育中，將雙歧桿菌乳酸菌 混合發(fā)酵菌按1:3000倍稀釋后噴施在黃瓜、茄子的開花到收獲的生長過程;可將雙歧桿菌 乳酸菌混合發(fā)酵菌按1:5000倍的稀釋后澆灌于果樹的根本。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物菌領(lǐng)域，具體為一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝及其運用；步驟包括：制備擴大菌種液和一級種子培養(yǎng)液得到一級菌種液，再將一級菌種液與種子培養(yǎng)基在種子罐混合培養(yǎng)得到種子罐菌種，再將所述的種子罐菌種與發(fā)酵罐培養(yǎng)基混合培養(yǎng)并通過誘導(dǎo)液進行發(fā)酵得到發(fā)酵液，當(dāng)發(fā)酵完畢后，進行發(fā)酵液離心，得到濕菌泥，其中濕菌泥即為雙歧桿菌乳酸菌的混合發(fā)酵菌泥；通過本發(fā)明制備出的雙歧桿菌混合菌具有菌的活性高，保質(zhì)期時間長，最大程度的使雙歧桿菌產(chǎn)生更多的有效物質(zhì)，避免了雙歧桿菌受到氧氣、水分、光線、保護基質(zhì)等條件的影響。
【IPC分類】C12R1/225, C12N1/20, A01N63/02, A01P3/00, C12R1/01
【公開號】CN105567590
【申請?zhí)枴緾N201511007402
【發(fā)明人】張起凡, 曹崇仁, 朱友峰
【申請人】山東環(huán)億生物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月30日