0g，胰蛋白胨 l〇g，酵母提取物5g，pH 7.0。
【附圖說明】
[0036] 圖1為本發(fā)明篩得Bacillus subtilis菌落形態(tài)圖；
[0037] 圖2為本發(fā)明篩得Bacillus subtilis個體形態(tài)圖；
[0038] 圖3為本發(fā)明脫膠的大麻效果圖；其中，圖3-1為大麻未經(jīng)脫膠效果圖，圖3-2為大 麻經(jīng)本發(fā)明篩得Bacillus subtil is脫膠效果圖；
[0039] 圖4為本發(fā)明大麻的電鏡圖；其中，圖4-1為大麻未經(jīng)過脫膠作用的電鏡圖，圖4-2 為大麻經(jīng)過Bacillus subtilis 16#脫膠作用的電鏡圖。
【具體實施方式】
[0040] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
[0041] 除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。對 于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料 成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0042]本發(fā)明所用培養(yǎng)基如下：
[0043]大麻富集培養(yǎng)基:大麻粉末2.0g，硝酸銨0.2g，磷酸氫二鉀0.05g，硫酸鈉0.05g，蒸 餾水 100mL，pH 7.0。
[0044] 果膠篩選培養(yǎng)基:果膠0.5g，硝酸銨0.2g，磷酸氫二鉀0. lg，硫酸鈉0.05g，硫酸鎂 〇 · 〇6g，瓊脂粉 2 · 0g，剛果紅 0· 02g，蒸餾水100mL，pH7 · 0~7 · 5。
[0045]木聚篩選糖培養(yǎng)基:木聚糖1.0g，硝酸鉀0. lg，硫酸鎂0.05g，氯化鈉0.05g，磷酸氫 二鉀0 · 05g，剛果紅0· 02g，瓊脂粉2 · 0g，蒸餾水100mL，pH7 · 0~7 · 5。
[0046] LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨1.0g，酵母提取物0.5g，氯化鈉1.0g，瓊脂粉2.0g，蒸餾水 100mL，pH 7.0。
[0047] 所述種子培養(yǎng)基的成分為LB瓊脂培養(yǎng)基，即1000mL培養(yǎng)基中含NaCl 10g，胰蛋白 胨1 〇g，酵母提取物5g，瓊脂18~20g，pH 7 · 0。
[0048] 所述種子液體培養(yǎng)基的成分為LB培養(yǎng)基，即1000mL培養(yǎng)基中含NaCl 10g，胰蛋白 胨l〇g，酵母提取物5g，pH 7.0。
[0049] 一種能同時產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌，名稱為16#，分類名稱為:枯 草芽孢桿菌Bacillus subtilis，保藏編號為:CGMCC No. 11898,保藏日期：2015年12月22 日，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心。
[0050] -種如上所述的能同時產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌的篩選方法，步驟 如下：
[0051 ] (1)菌株的篩選和分離：
[0052] 本發(fā)明篩選菌株所用的土樣來自處理生活垃圾的土壤中。
[0053] ①富集培養(yǎng):富集培養(yǎng):稱取采集到并凍干的菌粉置于大麻富集液體培養(yǎng)基中，所 述菌粉與大麻富集液體培養(yǎng)基的比例g:mL為1:150,在37°C下，180~220r/min富集培養(yǎng)24 小時。
[0054] ②初篩：富集培養(yǎng)后的菌液按照10倍梯度稀釋。用滅過菌的生理鹽水將富集的菌 液稀釋成1 0-1、1 0-2、1 0-3、1 0-4、1 0-5、1 0-6、1 0-7等不同稀釋度的樣品懸液，振蕩混勻后分別吸 取10-5、10-6、10- 7的菌懸液200yL，涂布于果膠(木聚糖)篩選固體培養(yǎng)基中，在37°C下倒置培 養(yǎng)24小時，通過剛果紅顯色，測量透明圈直徑(R)和菌落直徑(r)，以R/r的比值來初步判斷 菌株的產(chǎn)酶能力。然后挑取長勢較好，R/r的比值較大的單菌落，點接到木聚糖(果膠）固體 培養(yǎng)基中，在37°C下倒置培養(yǎng)24小時，挑選R/r的比值較大的單菌落在LB固體培養(yǎng)基中分離 純化。這樣分離純化后所得的細菌既能產(chǎn)果膠酶又能產(chǎn)木聚糖酶，然后把這些細菌保藏于 終質(zhì)量濃度為15%的甘油管中，于-80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0055] ③復(fù)篩:先將初篩所保藏的細菌在LB固體培養(yǎng)基中活化，以一環(huán)的接種量接種到 裝有50mL的液體LB的250mL的三角搖瓶的培養(yǎng)基中，37 °C下?lián)u瓶培養(yǎng)16小時作為種子液。稱 取4~10g原麻，先沸水浴處理30min后裝入250mL的三角搖瓶中加入自來水95mL，接入種子 液5mL(浴比1:20)，在37°C下（180~220r/min)脫膠10~12小時后取出，檢測殘膠率，選取殘 膠率低的菌株作為下步的脫膠菌。
[0056] (2)菌株的鑒定：
[0057]菌株的個體形態(tài)鑒定:對所篩得脫膠細菌首先進行形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)菌落呈乳白 色，菌落較大、粘稠、表面光滑不透明，邊緣整齊，較老的菌體表面起褶皺，如圖1所示。經(jīng)過 革蘭氏染色都顯陽性，桿短小，且在菌體中央形成芽孢，初步斷定2株菌都為芽孢桿菌屬，如 圖2所示。
[0058] 16SrDNA基因序列測定和分析：以16#菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增16S rDNA并測序。在NCBI上進行Blast分析表明：16#菌株的16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)16S rDNA序列的一致性高達99%。
[0059] 通過以上分離、篩選與菌株鑒定結(jié)果，確認該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)〇
[0060] 本發(fā)明的相關(guān)檢測結(jié)果：
[0061] 本發(fā)明能同時產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌的脫膠菌株果膠酶和木聚 糖酶酶活的測定：
[0062] 1、DNS法測定相關(guān)酶活
[0063] (l)DNS試劑的配置
[0064] 準確稱取3,5-二硝基水楊酸10.(^(化學(xué)純），加二次蒸餾水60〇11^，45°(：下水浴攪 拌，然后緩慢加入8.0g氫氧化鈉，并不斷攪拌，直到溶液清澈透明，再逐步加入四水合酒石 酸鉀鈉312.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g，不斷攪拌，直至完全溶解，冷卻至室溫后， 用蒸餾水定容至l〇〇〇mL，儲存于棕色瓶中并避光保存，室溫下存放15d后使用，保質(zhì)期為6個 月。
[0065] (2)pH 9.0的甘氨酸一氫氧化鈉緩沖溶液的配置
[0066] 50mL 0.2mol/L的甘氨酸與16.8mL 0.2mol/L的氫氧化鈉混合，加蒸餾水定容至 200mL〇
[0067] (3)標準曲線的制作
[0068] 準確稱取0.100g半乳糖醛酸(木糖），蒸餾水溶解并定容至100mL，即為lmg/mL的半 乳糖醛酸標準液。取16只25mL刻度管編號，依次加入0，0.1，0.3,0.5,0.7,0.9mL的標準液， 對應(yīng)的添加蒸餾水的體積為3.0，2.9，2.7，2.5，2.3，2. lmL，每組3個平行，不加標準液的對 照組1個平行。然后各加入2.0mL的DNS試劑，振蕩混勻后在沸水浴中準確反應(yīng)7min，取出后 立即用流水冷卻，然后用蒸餾水定容至25mL，在560nm處測定吸光值(0D)。以半乳糖醛酸(木 糖)的摩爾數(shù)(μπιο?)為橫坐標，0D值為縱坐標，繪制標準曲線。得到半乳糖醛酸標準曲線A =0 · 175Xi-0.135，R2 = 0.998準曲線：Y2 = 1.268X2-0.073，R2 = 0.998。
[0069] (4)底物溶液的配置
[0070] 果膠底物:準確稱取1.0000g果膠，用pH 9.0的緩沖液加熱溶解，并不斷攪拌，冷卻 至室溫后定容至l〇〇mL。低溫下保存?zhèn)溆茫４嫫跒?天。
[0071 ]木聚糖底物:準確稱取1.0000g木聚糖，用pH 9.0的緩沖液加熱溶解，并不斷攪拌， 冷卻至室溫后定容至100mL。低溫下保存?zhèn)溆茫４嫫跒?天。
[0072] (5)粗酶液的制備
[0073]將脫膠菌株在LB固體培養(yǎng)基中活化后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 °C 下，200r/min富集培養(yǎng)16h，在4°C下，8000r/min離心10min，所得上清液即為粗酶液。
[0074] (6)酶活的測定
[0075]酶活測定的主要步驟：
[0076] (1)取25mL的刻度管，加入經(jīng)適當(dāng)稀釋倍數(shù)的粗酶液lmL，底物2mL，充分混勻，以滅 活的酶液作為空白對照；
[0077] (2)在50°C水浴中反應(yīng)30min，取出；
[0078] (3)加入2mL DNS試劑并搖勻，立即沸水浴精確顯色5min，取出后流水冷卻，定容至 25mL，在540nm處測定0D值。一個酶活單位定義為，在上述的條件下，每分鐘水解底物生成1μ g還原