糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位。酶活力(U/mL)=還原糖量￥乂1'1/30;1'1為粗酶液的稀釋 倍數(shù)，30為酶促反應(yīng)時(shí)間(min)。測得16#果膠酶活力為198U/mL，木聚糖酶活力為124U/mL。
[0079] 經(jīng)檢測可以看出，本枯草芽孢桿菌能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶，幾乎不產(chǎn)纖維 素酶;96h內(nèi)能使大麻纖維的殘膠率降低到13%左右。
[0080] 本發(fā)明能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌在大麻纖維的脫膠應(yīng)用： [0081 ]先把保存于甘油管中的脫膠菌株在LB固體培養(yǎng)基中活化，然后接種到LB液體種子 培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)16~24h菌體濃度(OD600)達(dá)到2-2 · 6，種子液以5%~10% (體積 比）接種量轉(zhuǎn)接到大麻的慪麻液中，慪麻液可以是水，也可以是含有0.05%~1%氮源的水 溶液，氮源可以是硫酸銨、硝酸銨、尿素、草酸銨、碳酸銨等中的一種、幾種或全部，大麻與慪 麻液的質(zhì)量體積比為1:20~1:30，脫膠溫度為25~45°C，脫膠時(shí)間24~96h，靜置或者轉(zhuǎn)動， 搖床轉(zhuǎn)速為180~220rpm。
[0082]所述液體種子培養(yǎng)基的成分為LB液體培養(yǎng)基。
[0083]較優(yōu)地，所述脫膠培養(yǎng)基成分為:0.05g/mL大麻，0.002g/mL氮源，pH 7.0;
[0084] 較優(yōu)地，所述氮源為硝酸銨或硫酸銨；
[0085] 大麻脫膠后麻纖維完全發(fā)散，手感柔軟，色澤光亮潔白（圖3-2)，與未加菌液的對 照組（圖3-1)形成鮮明對比。通過掃描電子顯微鏡觀察，大麻原麻中，內(nèi)部的若干纖維束被 膠質(zhì)緊密包裹，幾乎看不到單根纖維結(jié)構(gòu)（圖4-1)，經(jīng)脫膠菌處理96h左右后，纖維表面光 滑，幾乎沒有損傷，單纖維束上的膠質(zhì)基本除去（圖4-2)。大麻脫膠后的殘膠率如表1，脫膠4 天，大麻殘膠率下降到8%~15%，較優(yōu)地是殘膠率達(dá)到13%，幾乎到達(dá)紡織工業(yè)的要求。
[0086] 表1.大麻經(jīng)枯草芽孢桿菌脫膠后的殘膠率表
[0087]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌，其特征在于：名稱為16#，分類 名稱為:枯草芽孢桿菌Baci 1 lus subti 1 is，保藏編號為:CGMCC No. 11898，保藏日期：2015 年12月22日，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心。2. -種如權(quán)利要求1所述的能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌的篩選方 法，其特征在于:步驟如下： ⑴菌株的篩選和分離： 篩選來自處理生活垃圾的土壤中的菌株，并將其凍干成菌粉； ① 富集培養(yǎng):稱取采集到并凍干的菌粉置于大麻富集液體培養(yǎng)基中，所述菌粉與大麻 富集液體培養(yǎng)基的比例g:mL為1:150，在37°C下，180~220r/min富集培養(yǎng)24小時(shí)； ② 初篩：富集培養(yǎng)后的菌液按照10倍梯度稀釋：用滅過菌的生理鹽水將富集的菌液稀 釋成1 0-1、10_2、10_3、10_4、10_ 5、10_6、10_7不同稀釋度的樣品懸液，振蕩混勻后分別吸取10_5、 10_ 6、10_7的菌懸液200yL，涂布于果膠篩選固體培養(yǎng)基或木聚糖篩選固體培養(yǎng)基中，在37°C 下倒置培養(yǎng)24小時(shí)，通過剛果紅顯色，測量透明圈直徑R和菌落直徑r，以R/r的比值來初步 判斷菌株的產(chǎn)酶能力； 然后挑取長勢較好，R/r的比值較大的單菌落，點(diǎn)接到果膠篩選固體培養(yǎng)基或木聚糖篩 選固體培養(yǎng)基中，在37°C下倒置培養(yǎng)24小時(shí)，挑選R/r的比值較大的單菌落在LB固體培養(yǎng)基 中分離純化； 這樣分離純化后所得的細(xì)菌既能產(chǎn)果膠酶又能產(chǎn)木聚糖酶，然后把這些細(xì)菌保藏于終 質(zhì)量濃度為15%的甘油管中，于_80°C凍存?zhèn)溆茫? ③ 復(fù)篩:先將初篩所保藏的細(xì)菌在LB固體培養(yǎng)基中活化，以一環(huán)的接種量接種到裝有 50mL的液體LB的250mL的三角搖瓶的培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u瓶培養(yǎng)16~24小時(shí)作為種子液，菌 體濃度〇〇 6〇()達(dá)到2~2.6; 稱取4-10g原麻，先沸水浴處理20~30min后裝入250mL的三角搖瓶中，接種5~10mL，以 浴比1:20~25加入含有0.2%氮源的自來水，所述氮源為硫酸銨、硝酸銨、尿素、草酸銨、碳 酸銨中的一種或幾種的混合物，在37°C下、180~220r/min脫膠10~12小時(shí)后取出，檢測殘 膠率，選取殘膠率低的菌株作為脫膠菌，命名為16#; ⑵菌株的鑒定： 菌株的個(gè)體形態(tài)鑒定:對所篩得的脫膠細(xì)菌首先進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)16#菌菌落呈乳 白色，菌落較大、粘稠、表面光滑不透明，邊緣整齊，較老的菌體表面起褶皺;經(jīng)過革蘭氏染 色都顯陽性，桿短小，且在菌體中央形成芽孢，初步斷定為芽孢桿菌屬； 16SrDNA基因序列測定和分析：以16#菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA并 測序； 在NCBI上進(jìn)行Blast分析表明：16#菌株的16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌16S rDNA序列 的一致性高達(dá)99%，即得能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌的篩選方法， 其特征在于:所述步驟⑴①中大麻富集液體培養(yǎng)基為： 大麻粉末2.0g，硝酸銨0.2g，磷酸氫二鉀0.05g，硫酸鈉0.05g，蒸餾水100mL，pH 7.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌的篩選方法， 其特征在于:所述步驟⑴②中果膠篩選固體培養(yǎng)基為:果膠0.5g，硝酸銨0.2g，磷酸氫二鉀 〇 · lg，硫酸鈉〇 · 〇5g，硫酸鎂0 · 06g，瓊脂粉2 · Og，剛果紅0 · 02g，蒸餾水lOOmL，pH 7 · 0~7 · 5; 或者，所述步驟⑴②中木聚糖篩選固體培養(yǎng)基為:木聚糖l.Og，硝酸鉀O.lg，硫酸鎂〇.〇5g， 氯化鈉0.05g，磷酸氫二鉀0.05g，剛果紅0.02g，瓊脂粉2. Og，蒸餾水lOOmL，pH 7.0~7.5。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌的篩選方法， 其特征在于:所述步驟⑴②中LB固體培養(yǎng)基為： 胰蛋白胨1. Og，酵母提取物0.5g，氯化鈉1. Og，瓊脂粉2. Og，蒸餾水lOOmL，pH 7.0。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌的篩選方法， 其特征在于:所述步驟⑴③中液體LB為； 胰蛋白胨1. Og，酵母提取物0.5g，氯化鈉1. Og，蒸餾水lOOmL，pH 7.0。7. -種如權(quán)利要求1所述的能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌在大麻脫膠 中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌在麻類脫膠中 的應(yīng)用，其特征在于： 以所述枯草芽孢桿菌為脫膠菌接種于液體種子培養(yǎng)基，置于37°C搖床中，180~220rpm 培養(yǎng)至16~24h，以體積比5%~10%接種量轉(zhuǎn)接到脫膠培養(yǎng)基中，脫膠培養(yǎng)基中含有麻類 原麻纖維，麻類與脫膠培養(yǎng)基的比例g :mL為1: 20~30，脫膠溫度為25~45 °C，搖床轉(zhuǎn)速為 180~220rpm，脫膠24~96h，即得脫膠后的大麻。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌在麻類脫膠中 的應(yīng)用，其特征在于:所述液體種子培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基或無機(jī)鹽培養(yǎng)基； 或者，所述麻類為大麻、苧麻或亞麻;或者，所述脫膠培養(yǎng)基為慪麻液，該慪麻液為水或者為 含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)〇 . 05 %~1 %氮源的水溶液，或者，為0.05g/mL大麻，0.002g/mL氮源，pH 7.0〇10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌在麻類脫膠 中的應(yīng)用，其特征在于:所述氮源為硫酸銨、硝酸銨、尿素、草酸銨、碳酸銨中的一種或幾種 的混合物;或者，所述液體種子培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基：1000mL培養(yǎng)基中含NaCl 10g，胰蛋 白胨l〇g，酵母提取物5g，pH 7.0。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的枯草芽孢桿菌，名稱為16#，分類名稱為：枯草芽孢桿菌Bacillus？subtilis，保藏編號為：CGMCC？No.11898，保藏日期：2015年12月22日，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本枯草芽孢桿菌能同時(shí)產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶，幾乎不產(chǎn)纖維素酶，將其應(yīng)用于大麻脫膠，常溫條件下脫膠96h左右，殘膠率可以降低到13％左右，幾乎到達(dá)紡織工業(yè)要求，該菌種還可以用于其他麻類脫膠中。CGMCC No.1189820151222
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/125, D01C1/04
【公開號】CN105567592
【申請?zhí)枴緾N201610010991
【發(fā)明人】黎明, 路福平, 楊田
【申請人】天津科技大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月5日