牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品檢測領(lǐng)域，具體涉及牛肉制品中豬肉成分含量定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于豬肉與牛肉、羊肉價格差別較大，近年來在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動下，以豬肉添加牛 肉香精、羊油、色素等添加劑冒充羊肉、牛肉及其制品的違法犯罪事件屢見不鮮。如浙江犯 罪團(tuán)伙用豬肉生產(chǎn)假牛肉干，一年多制造銷售達(dá)75噸；廣州思味食品的"億思"牌牛肉干以 豬肉和牛肉膏為原料，以假充真，兩年銷售2000萬元；內(nèi)蒙古不法分子豬肉冒充牛肉，添加 牛肉香精，將生產(chǎn)的假風(fēng)干牛肉銷往包頭周邊地區(qū)及陜西、寧夏等省市。這些事件損壞了消 費(fèi)者的利益，甚至危害消費(fèi)者身體健康。而且因穆斯林忌食豬肉，這些假牛羊肉也涉及到民 族和宗教問題。這些都嚴(yán)重動搖了消費(fèi)者對食品行業(yè)的信心。
[0003] 由于經(jīng)過色素、香精加工的豬肉紋理、色澤和氣味與牛肉、羊肉相似，普通消費(fèi)者 難以辨別，深加工過的假牛肉干等制品更是難以分辨。目前肉類成分鑒定的方法主要是根 據(jù)蛋白質(zhì)成分和基因序列，如色譜、酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法。目前 一些企業(yè)已經(jīng)開發(fā)出豬肉蛋白質(zhì)的ELISA檢測試劑盒和試劑條，但這些試劑盒和試劑條檢 測準(zhǔn)確性不高。實時熒光PCR(real-time PCR)方法具有靈敏度、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點，同時不需 要購買昂貴的試劑盒。目前肉類成分食品檢測標(biāo)準(zhǔn)主要基于實時熒光PCR方法，如SN/T 3730.8-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第8部分豬成分檢測實時熒光PCR 法》。
[0004] 但這些標(biāo)準(zhǔn)主要是對食品和飼料中豬、牛、雞等動物源成分進(jìn)行定性檢測，不能進(jìn) 行定量檢測，無法依據(jù)陽性結(jié)果判斷是因為生產(chǎn)者故意摻假還是生產(chǎn)中污染造成。同時因 為大部分檢測標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)基因是18S rRNA等多拷貝基因，檢測靈敏度非常高（可檢出 0.001%特定動物源性成分），容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。這些缺點限制使這些檢測標(biāo)準(zhǔn)無法作 為判斷是否慘假的依據(jù)，因此急需一種準(zhǔn)確快速的豬肉成分定量檢測方法作為肉類慘假判 定的依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于，提供牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法。
[0006] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題可以采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0007] 牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] 步驟一，樣品預(yù)處理；
[0009] 步驟二，DNA抽取；
[0010] 步驟三，DNA濃度和純度的測定；
[0011] 步驟四，實時熒光PCR反應(yīng)；
[0012] 步驟五，結(jié)果計算。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)行牛肉制品中豬肉成分含量定量檢測，檢測過程簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，并且提 取的豬肉濃度參考物質(zhì)DNA可以長時間保持，與購買商業(yè)試劑盒相比，成本低廉，滿足了豬 肉摻假鑒定的需要。
[0014] 所述步驟一中，所述樣品為干燥固體時，可直接以粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉;所述樣品為 濕狀時，經(jīng)冷凍干燥處理后，再研磨成細(xì)粉備用。
[0015] 作為一種方案，所述步驟二中，包括2-1:稱取兩個0.2g樣品試樣，至2ml離心管中， 加入900yL預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液和40yL蛋白酶K，輕輕混勻后，65°C水浴保溫30min;
[0016] 2-2:12000g離心5min，取上清于另一干凈的2ml離心管中，加入等體積的酚，三氯 甲烷和異戊醇的混合液(25:24:1 )，震蕩混勻；
[0017] 2-3:12000g離心5min，取上清至干凈的2ml離心管中，加入等體積的三氯甲烷和異 戊醇的混合液(24:1)，顛倒混勾，12000g離心10min，取上清至干凈的2ml離心管中；
[0018] 2-4:加入等體積異丙醇，顛倒混勾，12000g離心5min，棄去上清液;E.用4°C預(yù)冷的 70 %乙醇500yL，渦旋清洗沉淀，12000g離心5min，棄去上清液；
[0019] 2-5:倒置曬干后加100yL RNA酶A緩沖液，37°C溫育30min;
[0020] 2-6:重復(fù)步驟2-4、2-5，倒置曬干后加50yL TE緩沖液溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021]作為另一種方案，所述步驟二中，也可使用商品化DNA提取試劑盒提取DNA。
[0022]所述步驟三中，使用紫外分光光度計檢測提取的DNA的吸光值A(chǔ)260和A280,其 A260/A280比值應(yīng)在1.7~2.0之間，按以下公式計算DNA濃度：
[0023] c=A*N*50
[0024] C 一 DNA 濃度，單位為 ng/yL;
[0025] A-260nm處的吸光值
[0026] N-DNA稀釋倍數(shù)
[0027] 將DNA濃度稀釋到50ng/yL。
[0028] 所述步驟四中，還包括擴(kuò)增，擴(kuò)增時，應(yīng)設(shè)立兩個對照：陰性對照（牛基因組DNA)、 空白對照(不含DNA模板，可以水代替）；每個反應(yīng)，各濃度參考物質(zhì)和樣品試樣需設(shè)置三個 重復(fù)試驗;分別對豬特異性內(nèi)源基因和動物參照基因進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng);反應(yīng)體系如 下：
[0029] 2X TaqMan Universal PCR Master Mix.........12.5μ1
[0030] 上游引物 ΙΟμΜ.......................................0·5μ1
[0031] 下游引物 ΙΟμΜ.......................................0·5μ1
[0032] 探針...................................................〇·5μ1
[0033] DNA 模版................................................2μ1
[0034] ddH20 至總體積 25μ1
[0035] 反應(yīng)管離心后放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增：
[0036] 預(yù)變性:95°C 10min，l 個循環(huán)；
[0037] PCR擴(kuò)增：95°C 15sec;60°C 60sec，40個循環(huán)。
[0038] 所述步驟五中，使用熒光定量PCR儀隨機(jī)軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果;空白對照的豬特異 性內(nèi)源基因和動物參照基因應(yīng)無擴(kuò)增曲線；陰性對照、參考物質(zhì)和樣品的動物參照基因應(yīng) 出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，且Ct值小于30;陰性對照的豬特異性內(nèi)源基因應(yīng)無擴(kuò)增曲線;標(biāo)準(zhǔn)曲線制 作，根據(jù)實時熒光PCR分析結(jié)果，獲得不同濃度參考物質(zhì)的豬特異性內(nèi)源基因的Ct值和動物 參照基因的ct值，再求得三個重復(fù)試驗的ct值平均值，將參考物質(zhì)的豬特異性內(nèi)源基因的 ct值平均值減去動物參照基因的Ct值平均值后所得值A(chǔ)ct為縱坐標(biāo)，以參考物質(zhì)的豬肉成 分含量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0039] ACt=AlgN+B.......................................公式 1
[0040] ACt:豬特異性內(nèi)源基因的Ct值平均值減去動物參照基因的Ct值平均值。
[0041] N:豬肉成分含量 [0042] A:標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。
[0043] B:標(biāo)準(zhǔn)曲線Y軸之截距。
[0044] (注:如三個重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)偏離現(xiàn)象時，應(yīng)將該偏離數(shù)據(jù)舍棄，但每個濃度皆 應(yīng)有代表數(shù)據(jù)存在。）
[0045] 樣品中豬肉成分含量計算，根據(jù)實時熒光PCR分析結(jié)果，獲得樣品的的豬特異性內(nèi) 源基因的Ct值和動物參照基因的Ct值。再求得三個重復(fù)試驗的Ct值平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 公式1，按以下公式得出樣品中豬肉成分含量N( % ):
[0046]
[0047] 計算兩個樣品試樣的豬肉成分含量平均值H。
[0048]本發(fā)明中兩個樣品試樣中豬肉成分濃度見和他的相對偏差應(yīng)小于15%，艮口：
[0049]
[0050] 所述步驟四中，擴(kuò)增所述豬特異性內(nèi)源基因（目的基因 cytb)的引物和探針：
[0051 ]上游引物F1:5' -CGACAAAGCAACCCTCACAC-3'
[0052] 上游引物R1:5' -TGCGAGGGCGGTAATGAT-3'
[0053] 探針P1:5' -(FAiO-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTCHTAMRA)』'，其5 ' 端標(biāo)記FAM 報告熒光集團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光基團(tuán)；
[0054] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小70bp。
[0055] 所述步驟四中，擴(kuò)增所述動物參照基因（目的基因 12S rRNA)的引物和探針：
[0056] 上游引物F2:5' -CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3'
[0057] 上游引物R2:5' -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3'
[0058] 探針 PSA' -(FAiO-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGtXTAMRA)』'，其5'端標(biāo)記 FAM 報告熒光集團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光基團(tuán);PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小154~155bp。
[0059] 在應(yīng)用中，所述步驟四中，擴(kuò)增所述豬特異性內(nèi)源基因（目的基因 cytb)的引物和 探針、擴(kuò)增所述動物參照基因（目的基因 12S rRNA)的引物和探針的濃度為ΙΟμΜ。
【附圖說明】
[0060] 圖1為本發(fā)明的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0061] 為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體圖示進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0062] 參照圖1，牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法，包括以下步驟：
[0063] 步驟一，樣品預(yù)處理；
[0064] 步驟二，DNA抽??；
[0065] 步驟三，DNA濃度和純度的測定；
[0066]步驟四，實時熒光PCR反應(yīng)；
[0067] 步驟五，結(jié)果計算。
[0068] 本發(fā)明進(jìn)行牛肉制品中豬肉成分含量定量檢測，檢測過程簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，并且提 取的豬肉濃度參考物質(zhì)DNA可以長時間保持，與購買商業(yè)試劑盒相比，成本低廉，滿足了豬 肉摻假鑒定的需要。
[0069] 步驟一中，樣品為干燥固體時，可直接以粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉;樣品為濕狀時，經(jīng)冷 凍干燥處理后，再研磨成細(xì)粉備用。
[0070] 作為一種方案，步驟二中，包括2-1:稱取兩個0.