標(biāo)記TAMRA淬滅熒光基團(tuán)；
[0153] C、每個(gè)參考物質(zhì)和樣品試樣分別設(shè)置三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。
[0154] D、配置體系時(shí)，設(shè)立兩個(gè)對(duì)照：陰性對(duì)照（?；蚪MDNA)、空白對(duì)照(不含DNA模板， 以水代替）。
[0155] E、反應(yīng)體系如下：2X TaqMan Universal PCR Master Mix.........12·5μ1
[0156] 上游引物 ΙΟμΜ.......................................0·5μ1
[0157] 下游引物 ΙΟμΜ.......................................0·5μ1
[0158] 探針...................................................〇·5μ1
[0159] DNA 模版................................................2μ1
[0160] ddH20 至總體積 25μ1
[0161] F、反應(yīng)管離心后放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增：
[0162] 預(yù)變性:95°C 10min，l 個(gè)循環(huán)；
[0163] PCR擴(kuò)增：95°C 15sec;60°C 60sec，40個(gè)循環(huán)。
[0164](五）、結(jié)果計(jì)算
[0165] A、PCR反應(yīng)結(jié)束后，使用熒光定量PCR儀隨機(jī)軟件，按軟件默認(rèn)設(shè)置分析擴(kuò)增結(jié)果， 制作豬特異性內(nèi)源基因擴(kuò)增曲線，制作動(dòng)物參照基因擴(kuò)增曲線；
[0166] B、熒光PCR分析結(jié)果數(shù)據(jù)如下表：
[0167] 表3
[0168] [01l,」

[0170] Act:豬特異性內(nèi)源基因的ct值平均值減去動(dòng)物參照基因的ct值平均值
[0171] C、空白對(duì)照和陰性對(duì)照結(jié)果正常
[0172] D、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作以5個(gè)參考物質(zhì)ACt值為縱坐標(biāo)，豬肉成分含量(N)的對(duì)數(shù)為橫 坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式如下：
[0173] Δ Ct = _3.0807lgN-0.2994.......................................公式4
[0174] R2 = 0.9992
[0175] E、樣品中豬肉成分含量計(jì)算根據(jù)公式4得到公式5,將樣品的豬特異性內(nèi)源基因的 Ct值平均值減去動(dòng)物參照基因的Ct值平均值得到ACt。按以下公式5得出每個(gè)樣品中豬肉 成分含量N(見(jiàn)表4):
[0178]
[0179] 樣品1和樣品2中豬肉成分含量檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際含量相對(duì)誤差分別為-1.5%和 3.2%，說(shuō)明本發(fā)明檢測(cè)方法準(zhǔn)確性很高。即使牛肉制品中含有一些植物成分(如大豆），也 能得到很高的準(zhǔn)確性，能滿足日常牛肉制品中豬肉成分慘假定量檢測(cè)要求。對(duì)牛肉干檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)其中含有很高含量的豬肉成分(20.5%)，可以確認(rèn)廠家在牛肉干中故意摻入了豬肉成 分，排除了污染的可能性。使用本方法檢測(cè)牛肉制品可以為執(zhí)法部門(mén)執(zhí)法和維護(hù)消費(fèi)者利 益提供了有力證據(jù)。
[0180] 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變 化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其 等效物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括W下步驟： 步驟一，樣品預(yù)處理； 步驟二，DNA抽?。? 步驟Ξ，DNA濃度和純度的測(cè)定； 步驟四，實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)； 步驟五，結(jié)果計(jì)算。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟一 中，所述樣品為干燥固體時(shí)，直接W粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉;所述樣品為濕狀時(shí)，經(jīng)冷凍干燥處 理后，再研磨成細(xì)粉備用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟二 中，包括2-1:稱取兩個(gè)0.2g樣品試樣，至2ml離屯、管中，加入9(Κ)化預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液和 40化蛋白酶Κ，輕輕混勻后，65°C水浴保溫30min; 2-2:12000g離屯、5min，取上清于另一干凈的2ml離屯、管中，加入等體積的酪，Ξ氯甲燒 和異戊醇的混合液，震湯混勻； 2-3:12000g離屯、5min，取上清至干凈的2ml離屯、管中，加入等體積的Ξ氯甲燒和異戊醇 的混合液，顛倒混勻，12000g離屯、1 Omin，取上清至干凈的2ml離屯、管中； 2-4:加入等體積異丙醇，顛倒混勻，12000g離屯、5min，棄去上清液;E.用4°C預(yù)冷的70 % 乙醇50化L，滿旋清洗沉淀，12000g離屯、5min，棄去上清液； 2-5:倒置曬干后加10化L RNA酶A緩沖液，37°C溫育30min; 2-6:重復(fù)步驟2-4、2-5，倒置曬干后加50化TE緩沖液溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟二 中，使用商品化DNA提取試劑盒提取DNA。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟Ξ 中，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA的吸光值A(chǔ)260和A280，其A260/A280比值應(yīng)在1.7~ 2.0之間，按W下公式計(jì)算DNA濃度： C=A*r#50 C 一 DM濃度，單位為ng/yl^; A-260nm處的吸光值 N-DM稀釋倍數(shù) 將DNA濃度稀釋到SOngAiL。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟四 中，還包括擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)設(shè)立兩個(gè)對(duì)照：陰性對(duì)照、空白對(duì)照;每個(gè)反應(yīng)，各濃度參考物質(zhì) 和樣品試樣需設(shè)置Ξ個(gè)重復(fù)試驗(yàn);分別對(duì)豬特異性內(nèi)源基因和動(dòng)物參照基因進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光 PCR反應(yīng);反應(yīng)體系如下： 2X TaqMan Universal PCR Master Mix.........12.5μ1 上游引物ΙΟμΜ.......................................0.扣1 下游引物ΙΟμΜ.......................................0.扣1 探針...................................................0.扣1 DNA模版................................................化1 d地20至總體積25μ1 反應(yīng)管離屯、后放入巧光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增： 預(yù)變性:95°C10min，1個(gè)循環(huán)； PCR 擴(kuò)增:95°C 15sec; 60°C60sec，40 個(gè)循環(huán)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟五 中，使用巧光定量PCR儀隨機(jī)軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果;空白對(duì)照的豬特異性內(nèi)源基因和動(dòng)物參 照基因應(yīng)無(wú)擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照、參考物質(zhì)和樣品的動(dòng)物參照基因應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，且Ct值 小于30;陰性對(duì)照的豬特異性內(nèi)源基因應(yīng)無(wú)擴(kuò)增曲線;標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，根據(jù)實(shí)時(shí)巧光PCR分 析結(jié)果，獲得不同濃度參考物質(zhì)的豬特異性內(nèi)源基因的Ct值和動(dòng)物參照基因的Ct值，再求 得Ξ個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的Ct值平均值，將參考物質(zhì)的豬特異性內(nèi)源基因的Ct值平均值減去動(dòng)物參 照基因的Ct值平均值后所得值A(chǔ)ct為縱坐標(biāo)，W參考物質(zhì)的豬肉成分含量的對(duì)數(shù)為橫坐 標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： ACt=AlgN+B.......................................公式 1 Act:豬特異性內(nèi)源基因的Ct值平均值減去動(dòng)物參照基因的Ct值平均值。 N:豬肉成分含量 A:標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。 B:標(biāo)準(zhǔn)曲線Y軸之截距。 樣品中豬肉成分含量計(jì)算，根據(jù)實(shí)時(shí)巧光PCR分析結(jié)果，獲得樣品的的豬特異性內(nèi)源基 因的Ct值和動(dòng)物參照基因的Ct值。再求得Ξ個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的Ct值平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式 1，按W下公式得出樣品中豬肉成分含量N( %): ACt B ^ ....................................... N=10^ ^ ^xlOO% 厶A 計(jì)算兩個(gè)樣品試樣的豬肉成分含量平均值.巧。 兩個(gè)樣品試樣中豬肉成分濃度化和化的相對(duì)偏差應(yīng)小于15%，即：8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟四 中，擴(kuò)增所述豬特異性內(nèi)源基因的引物和探針： 上游引物F1:5' -CGACAAAGCAACCCTCACAC-3' 上游引物R1:5' -TGCGAGGGCGGTAATGAT-3' 探針P1:5' -(FAM)-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-(TAMRA)-3'，其5 ' 端標(biāo)記FAM報(bào)告 巧光集團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA澤滅巧光基團(tuán)； PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小70bp。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟四 中，擴(kuò)增所述動(dòng)物參照基因的引物和探針： 上游引物F2:5' -CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3' 上游引物R2:5' -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3' 探針P2:5' -(FAM)-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGC-(TAMRA)-3'，其5 ' 端標(biāo)記FAM報(bào)告 巧光集團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA澤滅巧光基團(tuán)； PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小154~15化p。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟 四中，擴(kuò)增所述豬特異性內(nèi)源基因的引物和探針、擴(kuò)增所述動(dòng)物參照基因的引物和探針的 濃度為ΙΟμΜ。
【專利摘要】本發(fā)明涉及食品檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及牛肉制品中豬肉成分含量定量檢測(cè)方法。牛肉制品中豬肉成分定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一，樣品預(yù)處理；步驟二，DNA抽??；步驟三，DNA濃度和純度的測(cè)定；步驟四，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)；步驟五，結(jié)果計(jì)算。本發(fā)明進(jìn)行牛肉制品中豬肉成分含量定量檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，并且提取的豬肉濃度參考物質(zhì)DNA可以長(zhǎng)時(shí)間保持，與購(gòu)買(mǎi)商業(yè)試劑盒相比，成本低廉，滿足了豬肉摻假鑒定的需要。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105567801
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510801181
【發(fā)明人】趙玉簪
【申請(qǐng)人】英格爾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)（上海）有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2015年11月19日