2g樣品試樣，至2ml離心管中，加入 900yL預熱的CTAB裂解緩沖液和40yL蛋白酶K，輕輕混勻后，65°C水浴保溫30min;
[0071] 2-2:12000g離心5min，取上清于另一干凈的2ml離心管中，加入等體積的酚，三氯 甲烷和異戊醇的混合液(25:24:1 )，震蕩混勻；
[0072] 2-3:12000g離心5min，取上清至干凈的2ml離心管中，加入等體積的三氯甲烷和異 戊醇的混合液(24:1)，顛倒混勾，12000g離心10min，取上清至干凈的2ml離心管中；
[0073] 2-4:加入等體積異丙醇，顛倒混勾，12000g離心5min，棄去上清液;E.用4°C預冷的 70 %乙醇500yL，渦旋清洗沉淀，12000g離心5min，棄去上清液；
[0074] 2-5:倒置曬干后加100yL RNA酶A緩沖液，37°C溫育30min;
[0075] 2-6:重復步驟2-4、2-5，倒置曬干后加50yL TE緩沖液溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0076]作為另一種方案，步驟二中，也可使用商品化DNA提取試劑盒提取DNA。
[0077] 步驟三中，使用紫外分光光度計檢測提取的DNA的吸光值A260和A280,其A260/ A280比值應在1.7~2.0之間，按以下公式計算DNA濃度：
[0078] c=A*N*50
[0079] C 一 DNA 濃度，單位為 ng/yL;
[0080] A-260nm處的吸光值
[0081 ] N-DNA稀釋倍數
[0082] 將DNA濃度稀釋到50ng/yL。
[0083] 步驟四中，還包括擴增，擴增時，應設立兩個對照：陰性對照（?；蚪MDNA)、空白 對照(不含DNA模板，可以水代替）；每個反應，各濃度參考物質和樣品試樣需設置三個重復 試驗;分別對豬特異性內源基因和動物參照基因進行實時熒光PCR反應;反應體系如下：
[0084] 2X TaqMan Universal PCR Master Mix.........12.5μ1
[0085] 上游引物 ΙΟμΜ.......................................0·5μ1
[0086] 下游引物 ΙΟμΜ.......................................0·5μ1
[0087] 探針...................................................〇·5μ1
[0088] DNA 模版................................................2μ1
[0089] ddH20 至總體積 25μ1
[0090] 反應管離心后放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增：
[0091] 預變性:95°C 10min，l 個循環(huán)；
[0092] PCR擴增：95°C 15sec;60°C 60sec，40個循環(huán)。
[0093] 步驟五中，使用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果；空白對照的豬特異性內 源基因和動物參照基因應無擴增曲線；陰性對照、參考物質和樣品的動物參照基因應出現 擴增曲線，且Ct值小于30;陰性對照的豬特異性內源基因應無擴增曲線;標準曲線制作，根 據實時熒光PCR分析結果，獲得不同濃度參考物質的豬特異性內源基因的Ct值和動物參照 基因的Ct值，再求得三個重復試驗的Ct值平均值，將參考物質的豬特異性內源基因的Ct值 平均值減去動物參照基因的Ct值平均值后所得值ACt為縱坐標，以參考物質的豬肉成分含 量的對數為橫坐標，進行線性回歸分析并制作標準曲線：
[0094] ACt=AlgN+B.......................................公式 1
[0095] ACt:豬特異性內源基因的Ct值平均值減去動物參照基因的Ct值平均值。
[0096] N:豬肉成分含量
[0097] A:標準曲線斜率。
[0098] B:標準曲線Y軸之截距。
[0099] (注:如三個重復試驗結果出現偏離現象時，應將該偏離數據舍棄，但每個濃度皆 應有代表數據存在。）
[0100] 樣品中豬肉成分含量計算，根據實時熒光PCR分析結果，獲得樣品的的豬特異性內 源基因的ct值和動物參照基因的ct值。再求得三個重復試驗的ct值平均值。根據標準曲線 公式1，按以下公式得出樣品中豬肉成分含量N( %):
[0101]
[0102] 計算兩個樣品試樣的豬肉成分含量平均值N。
[0103] 本發(fā)明中兩個樣品試樣中豬肉成分濃度NdPN2的相對偏差應小于15%，即：
[0104]
[0105] 步驟四中，擴增豬特異性內源基因（目的基因 cytb)的引物和探針：
[0106] 上游引物F1:5' -CGACAAAGCAACCCTCACAC-3'
[0107] 上游引物R1:5' -TGCGAGGGCGGTAATGAT-3'
[0108] 探針PI :57 -(FAiO-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTCHTAMRA)』'，其5'端標記FAM 報告熒光集團，3'端標記TAMRA淬滅熒光基團；
[0109] PCR擴增產物大小70bp;
[0110] 步驟四中，擴增動物參照基因（目的基因12S rRNA)的引物和探針：
[0111] 上游引物F2:5' -CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3'
[0112] 上游引物R2:5' -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3'
[0113] 探針 PSA' -(FAiO-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGtXTAMRA)』'，其5'端標記 FAM 報告熒光集團，3'端標記TAMRA淬滅熒光基團;PCR擴增產物大小154~155bp;
[0114] 在應用中，以上上游引物、下游引物及探針的濃度為ΙΟμΜ。
[0115] 實例 1:
[0116] 樣品1:模擬牛肉制品（豬肉成分含量為8.87 %:將202.6mg豬肉和2.0822g牛肉放 入粉碎機中，混合粉碎成肉糜），分別取兩份〇.5g試樣(al和bl)檢測，驗證本方法的準確性。
[0117] 樣品2:模擬牛肉制品（豬肉成分含量為24.8% :將1.123g豬肉、3.403g牛肉和 3.005g大豆粉放入粉碎機中，混合粉碎成肉糜），分別取兩份0.5g試樣(a2和b2)檢測，驗證 本方法的準確性。
[0118] 樣品3:牛肉干，100g，購于某超市，用粉碎機研磨成細粉;分別取兩份0.5g(a3和 b3)試樣檢測，驗證檢測一般牛肉制品。
[0119] ( -制作含不同豬肉成分含量的參考物質，步驟如下：
[0120] 1、購買新鮮合適的豬肉和牛肉，剔除豬皮、牛筋、脂肪等肌肉以外成分；
[0121 ] 2、分別用粉碎機將豬肉和牛肉絞碎成肉糜，將肉糜冷凍干燥后，再用粉碎機研磨 成細粉；
[0122] 3、用豬肉粉和牛肉粉配置含不同豬肉成分含量的參考物質（Stdl、Std2、Std3、 Std4和Std5)，具體豬肉成分含量如下表：
[0123] 表1
[0124]
[0125] 4、將參考物質混合均勻。
[0126] (二）.DNA 抽取
[0127] A.稱取3個樣品的6個試樣和5個參考物質0.5g，加至15ml離心管中，加入5mL預熱 的CTAB裂解緩沖液和100yL蛋白酶K，輕輕混勻后，65°C水浴保溫40min;
[0128] B.12000g離心5min，取900yL上清于另一干凈的2ml離心管中，加入等體積的酚，三 氯甲烷和異戊醇的混合液(25:24:1 )，震蕩混勻；
[0129] C.12000g離心5min，取上清至干凈的2ml離心管中，加入等體積的三氯甲烷和異戊 醇的混合液(24:1)，顛倒混勾，12000g離心10min，取上清至干凈的2ml離心管中；
[0130] D.加入等體積異丙醇，顛倒混勻，12000g離心5min，棄去上清液；
[0131] E.用4°C預冷的70%乙醇500yL，渦旋清洗沉淀，12000g離心5min，棄去上清液；
[0132] F.，倒置曬干后加100yL RNA酶A緩沖液，37°C溫育30min;
[0133] G.重復步驟D、E，倒置曬干后加50yL TE緩沖液溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0134] (三）.DNA濃度和純度的測定
[0135] 使用紫外分光光度計檢測提取的DNA溶液的吸光值A260和A280,計算A260/A280比 值，按以下公式計算DNA濃度：
[0136] c=A*N*50
[0137] C 一 DNA 濃度，單位為 ng/yL;
[0138] A-260nm處的吸光值
[0139] N-DNA稀釋倍數
[0140] 提取的樣品和參考物質DNA溶液的濃度和純度如下表：
[0141] 表2
[0142]
[0143] DNA 濃度稀釋到 50ng/yL。
[0144] (四）·實時熒光PCR反應
[0145] A、分別對豬特異性內源基因和動物參照基因進行實時熒光PCR反應。豬特異性內 源基因（目的基因 cytb)的引物和探針序列如下：
[0146] 上游引物F1:5' -CGACAAAGCAACCCTCACAC-3'
[0147] 上游引物R1:5' -TGCGAGGGCGGTAATGAT-3'
[0148] 探針P1:5' -(FAiO-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTCHTAMRA)』'，其5 ' 端標記FAM 報告熒光集團，3'端標記TAMRA淬滅熒光基團；
[0149] B、動物參照基因（目的基因12S rRNA)的引物和探針如下：
[0150] 上游引物F2:5' -CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3'
[0151 ]上游引物R2:5' -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3'
[0152] 探針-(FAiO-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGtXTAMRA)。'，其5'端標記FAM 報告熒光集團，3'端