滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的銅納米顆粒合成方法及其在電化學(xué)檢測中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的銅納米顆粒合成方法 及其在電化學(xué)檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基于目標(biāo)分子和生物識別分子之間的特異性相互作用對疾病的生物標(biāo)志物進(jìn)行 檢測對臨床診斷有重要意義。通常，通過光學(xué)方法和電化學(xué)方法可以實現(xiàn)將這種生物綁定 作用轉(zhuǎn)換為可測量的信號。其中，光學(xué)方法具有高靈敏度，然而，這種信號轉(zhuǎn)換方式不僅需 要高精度的昂貴的儀器，也涉及到復(fù)雜的數(shù)值算法來分析數(shù)據(jù)，因此限制了這種方法的廣 泛應(yīng)用。而電化學(xué)裝置也能把生物反應(yīng)轉(zhuǎn)換成可檢測的電信號，而且為醫(yī)療診斷提供了一 個簡單、準(zhǔn)確和便宜的平臺，并且很有可能實現(xiàn)便攜的，實時現(xiàn)場的檢測。更重要的是，結(jié)合 電化學(xué)信號讀出方法與各種行之有效的信號放大策略，可以得到高靈敏度、高特異性、高效 的親和性電化學(xué)生物傳感器用于檢測疾病標(biāo)志物。
[0003] 為了提高電化學(xué)生物傳感器檢測的靈敏度，基于DNA擴(kuò)增技術(shù)的信號放大策略引 起了人們研究的興趣，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)(SDA)，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法 (LAMP)，雜交連鎖反應(yīng)(HCR)和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)。在這些DNA擴(kuò)增技術(shù)中，RCA是一個簡單 而強(qiáng)大的等溫酶促過程，短的DNA或RNA引物在環(huán)狀DNA模板和獨特的DNA和RNA聚合酶的協(xié) 助下發(fā)生鏈延伸，形成單鏈的DNA或RNA長鏈。由于快速、高效和特異性好等優(yōu)點，RCA在眾多 分析應(yīng)用中被廣泛用于信號放大，如核酸、小分子、蛋白質(zhì)、和病變細(xì)胞的檢測，檢測的目標(biāo) 甚至可以在aM濃度級別。RCA產(chǎn)物包含成千上萬的串聯(lián)重復(fù)序列，它們和環(huán)形模板是互補 的。把這些串聯(lián)重復(fù)序列轉(zhuǎn)換成可檢測電信號的讀出方法對于實現(xiàn)各種分析目的是至關(guān)重 要的。最常見的讀出RCA產(chǎn)物的方法是與連有指示劑的互補寡核苷酸短鏈進(jìn)行雜交，指示劑 有熒光團(tuán)，納米粒子，量子點，聯(lián)吡啶釕和酶等。相比之下，這種雜交方法涉及冗雜和耗時的 過程，而另一種利用DNA插入分子的方法表現(xiàn)出相當(dāng)大的便捷性，已被廣泛用于讀取RCA產(chǎn) 物，插入分子包括亞甲基藍(lán)，焚光染料，N-甲基Π 卜啉二丙酸IX，銀納米粒子等。
[0004]最近，一種以DNA為模板合成的金屬納米顆粒作為DNA信號標(biāo)記物出現(xiàn)，由于其毒 性低，生物相容性好，光學(xué)特性優(yōu)良，以及DNA識別和信號放大的集成策略的易實現(xiàn)，在生物 分析方面吸引了越來越濃的興趣。例如，富含胞嘧啶的DNA可以作為一種有效的制備銀納米 團(tuán)簇顆粒的模板，這已廣泛用于核酸、小分子、蛋白質(zhì)、和癌細(xì)胞的檢測。除了 DNA模板化的 銀納米團(tuán)簇顆粒以外，DNA模板化的銅納米團(tuán)簇顆粒，包括隨機(jī)雙鏈DNA模板化的銅納米團(tuán) 簇顆粒和聚胸腺嘧啶模板化的銅納米團(tuán)簇顆粒，在生物傳感方面已經(jīng)吸引了越來越多的關(guān) 注。以DNA為模板合成CuNPs可以在反應(yīng)開始后幾分鐘內(nèi)完成，比其他DNA模板化金屬納米顆 粒的合成更快、更方便。高效、簡單和快速的合成工藝使DNA模板化CuNPs在各種生物分析應(yīng) 用方面具有廣闊前景。雙鏈DNA模板化的CuNPs已經(jīng)被用于檢測小分子，酶活性，核酸和金屬 離子，并且結(jié)合HCR或RCA等DNA擴(kuò)增技術(shù)能實現(xiàn)高靈敏度檢測。與雙鏈DNA模板化的CuNPs相 比較，以聚胸腺嘧啶為模板合成的CuNPs在生物分析中的應(yīng)用還處于非常初期的階段。特別 的是，以聚胸腺嘧啶為模板合成的CuNPs可以在沒有鏈雜交的情況下合成，也就是說，只有 包含超過15個連續(xù)胸腺嘧啶的單鏈的序列能引起明顯的CuNPs形成，這是非常簡單和明確 的。此外，CuNPs的產(chǎn)率與以聚胸腺嘧啶的長度和數(shù)量高度相關(guān)，所以與可編程DNA擴(kuò)增技術(shù) 結(jié)合設(shè)計開發(fā)高選擇性和靈敏度的生物傳感器。眾所周知，RCA可以有效地生成成千上萬的 單鏈的串聯(lián)重復(fù)序列，可以直接作為CuNPs形成的模板。由此我們可以想象，用CuNPs標(biāo)記 RCA在生物分析應(yīng)用上是一個完美的策略，兼具高靈敏度和選擇性。
[0005] 到目前為止，大多數(shù)基于DNA模板化的CuNPs分析方法基本上是熒光檢測。然而，單 個的CuNPs熒光發(fā)射只能持續(xù)20分鐘，然后光強(qiáng)迅速下降，這可能會大大阻礙其在長期監(jiān)測 方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在本工作中，結(jié)合電化學(xué)方法在測定金屬離子方面的優(yōu)越性，利用電化學(xué)讀取方 法可以克服這一缺陷。我們設(shè)計了基于CuNPs標(biāo)記的RCA級聯(lián)信號放大策略，以電化學(xué)信號 讀取方式，對前列腺特異性抗原(PSA)模型目標(biāo)分子進(jìn)行了檢測，如圖1所示。引物-AuNPs-適配體/PSA/anti-PSA三明治結(jié)構(gòu)的形成引發(fā)了 RCA反應(yīng)及隨后CuNPs的形成。用凝膠電泳 證實了RCA過程。通過透射電子顯微鏡(TEM)對以RCA產(chǎn)物為模板的CuNPs進(jìn)行了表征。通過 微分脈沖溶出伏安法(DPSV)檢測從CuNPs溶解釋放的大量的銅離子，可以評估PSA目標(biāo)物的 量。對可能會影響分析性能的實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化。建立了滴定曲線并確定了 PSA檢測極 限。最后，利用所建立的方法測定了臨床血清實際樣品中PSA的含量。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 以滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物為模板合成的銅納米顆粒CuNPs在電化學(xué)檢測癌癥標(biāo)志物中 的應(yīng)用。
[0009] 以滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物為模板合成的銅納米顆粒CuNPs在電化學(xué)生物分析中的應(yīng) 用。
[0010]以滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物為模板合成的銅納米顆粒CuNPs在電化學(xué)檢測人類前列腺特 異性抗原PSA中的應(yīng)用。
[0011] 一種基于DNA模板化的CuNPs電化學(xué)檢測癌癥標(biāo)志物的方法，包括如下步驟：
[0012]構(gòu)建能夠與環(huán)狀模板雜交并觸發(fā)RCA反應(yīng)的"primer-AuNP-aptamer/抗原/抗體" 三明治結(jié)構(gòu)；
[0013] 引發(fā)了RCA反應(yīng)，形成一個包含連續(xù)多個胸腺嘧啶的串聯(lián)重復(fù)序列單鏈DNA;
[0014] 合成 CuNPs;
[0015] 溶解上述CuNPs，以電化學(xué)方法檢測Cu+含量；
[0016] 根據(jù)Cu+與癌癥標(biāo)志物含量的對應(yīng)關(guān)系，確定待測液中癌癥標(biāo)志物的含量。
[0017] 優(yōu)選的，所述"primer-AuNP-aptamer/抗原/抗體"三明治結(jié)構(gòu)由primer-AuNP-aptamer生物共輒體與相應(yīng)的抗體、抗原特異結(jié)合而成。
[0018] 優(yōu)選的，所述primer-AuNP-aptamer生物共輒體能夠特異性識別相應(yīng)的癌癥抗原 或癌癥標(biāo)志物并且形成三明治夾心結(jié)構(gòu)。
[0019] 優(yōu)選的，所述primer-AuNP-aptamer生物共輒體通過金納米粒子AuNPs和DNA序列 間的Au-S鍵結(jié)合。
[0020]優(yōu)選的，所述金納米粒子AuNP作為載體增加了引物/適體的比例，從而放大信號。 [0021 ] 優(yōu)選的，在T4連接酶和環(huán)狀模板DNA存在的情況下，primer-AuNP-aptamer生物共 輒體中的引物可以與環(huán)狀模板進(jìn)行雜交并且在phi29DNA聚合酶的協(xié)助下進(jìn)一步觸發(fā)RCA反 應(yīng)。
[0022]本發(fā)明還提供了一種基于DNA模板化的CuNPs電化學(xué)檢測人類人類前列腺特異性 抗原PSA的方法，包括如下步驟：
[0023]構(gòu)建能夠與環(huán)狀模板雜交并觸發(fā)RCA反應(yīng)的"引物primer-納米金AuNP-適配體 aptamer/PSA/PSA 抗體 anti-PSA" 三明治結(jié)構(gòu)；
[0024]引發(fā)了RCA反應(yīng)，形成一個包含連續(xù)多個胸腺嘧啶的串聯(lián)重復(fù)序列單鏈DNA;
[0025] 合成 CuNPs;
[0026] 溶解上述CuNPs，以電化學(xué)方法檢測Cu+含量。
[0027] 優(yōu)選的，所述"pr imer-AuNP-aptamer/抗原/抗體"三明治結(jié)構(gòu)由primer-AuNP-aptamer生物共輒體與相應(yīng)的抗體