6)加入到反應(yīng)孔中，并且在37°C下培養(yǎng)lh。結(jié)束后，將反應(yīng)孔中的殘余液體移除。 為了進行RCA反應(yīng)，將2.5yL10X反應(yīng)緩沖液（330mM Tris-acetate，100mM Mg(Ac)2,660mM potassium acetate(KAc),1 % Tween 20and lOmM DTT,pH 7.9),0.125yL(10u/yL) phi29DNA polymerase，5yL lOmM dNTPs，and 17.5yL H20添加到反應(yīng)孔中，在37°C下培養(yǎng) 80min后，用TE緩沖液沖洗反應(yīng)孔三次。隨后，添加抗壞血酸鈉和硫酸銅。CuNPs的形成反應(yīng) 在室溫下進行30min，最后，輕輕地清洗反應(yīng)孔三次。
[0053] 1.6.電化學(xué)測量
[0054]首先，使用0.05μπι的氧化鋁研磨液將金圓盤電極在麂皮上鏡面拋光。然后超聲處 理15s以除去氧化鋁顆粒和其他雜質(zhì)，并先后用超純水和乙醇進行清洗。為了進一步清潔和 激活電極表面，將金圓盤電極放入〇 . 5M的硫酸溶液中，使用循環(huán)伏安法在1 OOmV/s掃速下 于-0.2V至1.6V之間進行掃描，直到得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。然后電極用超純水徹底清洗 以便于以后的使用。另一方面，將以RCA產(chǎn)物為模板合成的銅納米粒子在濃硝酸中溶解 30min后轉(zhuǎn)化為Cu 2+，并將溶液稀釋至0.5M硝酸。最后，用活化過的金圓盤電極檢測溶液中的 Cu2+。循環(huán)伏安法在-0.2V至0.6V的電位范圍內(nèi)進行，掃描速度為50mV/s。溶出伏安法的參數(shù) 設(shè)置如下：掃描范圍：. 2V至0.6V;電勢增幅:0.004V;振幅0.05V;脈沖寬度:0.05s;脈沖周 期:0 · 5s;沉積電位:-0 · 5V;沉積時間：300s 〇 [0055] 1.7瓊脂糖電泳分析
[0056]為了驗證RCA反應(yīng)，我們進行了凝膠電泳實驗。凝膠電泳是用0.7%的瓊脂糖凝膠 在TAE緩沖溶液(40mM三氨基甲烷，20mM醋酸，2. OmM乙二胺四乙酸，pH 8.3)中恒定電壓120V 下進行1.5h。在溴化乙錠溶液中染色5min后，凝膠電泳在Tanon-2500R成像系統(tǒng)（上海，中 國）中成像。
[0057] 2、結(jié)果與討論
[0058] 2.1.設(shè)計原理
[0059] 本設(shè)計方案的原理如圖1所示。固定在培養(yǎng)板孔中的Anti-PSA和處于primer- AuNP-aptamer生物共輒體中的適配體能夠特異性識別PSA并且形成三明治夾心結(jié)構(gòu)。在這 里，金納米粒子作為載體增加了引物/適體的比例，從而放大信號。在T4連接酶和環(huán)狀模板 DNA存在的情況下，primer-AuNP-aptamer生物共輒體中的引物可以與環(huán)狀模板進行雜交并 且在phi29DNA聚合酶的協(xié)助下進一步觸發(fā)RCA反應(yīng)。由于模板設(shè)計包含著50個連續(xù)的腺嘌 呤堿基，因此所得的RCA產(chǎn)物是一個包含連續(xù)50個胸腺嘧啶的串聯(lián)重復(fù)序列單鏈DNA。在Cu 2+ 和抗壞血酸鹽存在的條件下，每50個胸腺嘧啶都可以作為特定模板合成銅納米顆粒。經(jīng)洗 滌后，在孔中加入濃硝酸，以RCA產(chǎn)物為模板形成的銅納米粒子可以溶解并且釋放大量的 Cu2+，然后用伏安法測量其中的銅離子，以確定被測PSA的量。相比之下，當(dāng)PSA目標(biāo)物不存在 時，該流程將無法進行，將不會測得相應(yīng)的電化學(xué)信號。因此，被測目標(biāo)物PSA的量可以通過 該方案進行靈敏檢測。
[0060] 2.2表征
[0061]瓊脂糖凝膠電泳實驗用來驗證RCA反應(yīng)。如圖2A所示，RCA產(chǎn)物表現(xiàn)出極低的流動 性(條帶a)，說明該產(chǎn)物具有很高的分子量。根據(jù)指示劑條帶(條帶c)所顯示的結(jié)果，RCA產(chǎn) 物中的堿基數(shù)遠高于15000bp，這表明RCA反應(yīng)成功地實現(xiàn)了。相反，在沒有引物(條帶b)的 控制實驗中，RCA不能被觸發(fā)，所加的短的DNA鏈快速地游出了凝膠，因此沒有觀察到任何條 帶。這些結(jié)果證明RCA反應(yīng)成功進行。
[0062] 我們用TEM證實了銅納米粒子在RCA產(chǎn)物上的合成。如圖2B所示，在RCA產(chǎn)物的TEM 圖像中，觀察到灰色的團狀物質(zhì)，這實際上是殘留在團狀RCA產(chǎn)物表面的鹽所形成的圖像。 單個RCA團狀物的直徑約為Ιμπι，這跟之前的報告一致。有趣的是，在與Cu 2+和抗壞血酸反應(yīng) 之后，RCA團狀物中出現(xiàn)了直徑約為100nm的黑色納米粒子(圖2C)，表明了銅納米顆粒在RCA 產(chǎn)物上的成功形成。與之前文獻所報道的在40個連續(xù)胸腺嘧啶序列上形成的直徑5nm的銅 納米粒子相比，在本工作中銅納米粒子尺寸的增加主要是由于團狀的RCA產(chǎn)物中串聯(lián)的50 個連續(xù)的胸腺嘧啶使形成的銅納米粒子發(fā)生了聚集。
[0063]我們進一步用CV和DPSV對所設(shè)計的方案進行了電化學(xué)表征。圖3A為沒有PBS的空 白試驗和有1.0pg/mL PSA存在的實驗的CV響應(yīng)?？瞻讓嶒灥腃V圖沒有氧化還原峰（曲線a)， 相反，當(dāng)有1.〇pg/mL PSA存在時，所得CV在0.33/0.28V附近出現(xiàn)了一對顯著的氧化還原峰， 這與溶解的Cu2+的氧化還原反應(yīng)相對應(yīng)，表明本工作所設(shè)計的銅納米顆粒報道RCA擴增的信 號放大策略用于PSA的檢測是可行的。另外，當(dāng)有1.0pg/mL PSA存在時，我們用高靈敏的 DPSV對所得的銅離子進行檢測，得到更加明顯的氧化電流信號（圖3A的插圖），從而提高了 檢測方法的靈敏度。因此，在后續(xù)實驗中，DPSV被用來進行電化學(xué)測試。
[0064]為了驗證所用金納米粒子在信號放大中的作用，我們進行了沒有金納米粒子載體 的對照實驗。在實驗中，我們用一段包含引物片段和適體片段的DNA序列（表示為primer-aptamer)來代替primer-AuNP-aptamer生物共輒體，對1 · 0pg/mL PSA進行檢測，在形成 primer-aptamer/PSA/anti-PSA三明治結(jié)構(gòu)后，進行后續(xù)的RCA反應(yīng)和CuNPs合成，并通過 DPSV測量從形成的銅納米顆粒上溶解的Cu2+。圖3B比較了在使用primer-AuNP-aptamer及 primer-aptamer對1 · 0pg/mL PSA進行檢測時所得的DPSV響應(yīng)曲線（分別為曲線a和曲線b)。 顯然，前者的電流強度大約是后者的7倍，證實primer-AuNP-aptamer生物共輒體通過增大 primer和aptamer的比例，對可測信號進行了放大。
[0065] 2.3實驗條件的優(yōu)化
[0066]為了達到所建立方法的最佳效果，我們優(yōu)化了可能顯著影響分析效果的實驗條 件，包括pr imer-AuNP-aptamer生物共輒中的引物/適體比例、RCA反應(yīng)時間、DPSV沉積電位 和沉積時間等參數(shù)。為了達到引物-金納米粒子-適配體的生物共輒體最大的信號放大能 力，我們改變引物/適體的比例（2:1、3 :1、4:1、5:1、6:1和7:1，用固定的20〇1^適體)合成了 引物-金納米粒子-適配體的生物共輒體，并研究了不同的引物/適體比例對于相應(yīng)信號的 影響。如圖4A中顯示，隨著引物/適體比的增加電流響應(yīng)顯著增加，在5:1達到最高值，然后 當(dāng)引物/適體比率高于5:1開始降低。電流的降低可能是由于過量的引物占據(jù)了納米金顆粒 上本來屬于適體的結(jié)合部位，以至于形成了不含有適體的生物共輒體。因此，5:1的引物/適 體比例被用來合成引物-金納米粒子適配子的生物共輒體。
[0067] 為了盡可能生成長的RCA產(chǎn)物以便提高信號放大倍數(shù)，我們對RCA反應(yīng)時間對電化 學(xué)信號響應(yīng)的影響進行了研究，如圖4B所示。開始時，響應(yīng)隨著RCA反應(yīng)時間的增加顯著增 強，表明RCA產(chǎn)物的有效擴增。然而，該響應(yīng)的上升速度在60分鐘后減慢并在80分鐘時達到 飽和，這可能是由于RCA反應(yīng)底物的耗盡或phi 29DNA聚合酶的失活所導(dǎo)致的。因此，在接下 來的RCA反應(yīng)中，80分鐘被選定為充分的反應(yīng)時間。
[0068] 因為溶解的銅離子的濃度反映了 PSA的量，因此銅離子的靈敏檢測在整個試驗中 具有顯著重要性。因此，對