沉積電位和沉積時(shí)間等重要的DPSV參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。我們通過改 變銅沉積時(shí)所施加的沉積電位來研究其對電化學(xué)信號(hào)的影響。如圖4C所示，隨著施加電位 從-0.1 V變化至-0.5V，電流響應(yīng)逐漸增加，然后在-0.5V以上幾乎達(dá)到恒定值。因此，-0.5V 被用作Cu2+DPSV分析的沉積電位。圖4D顯示了沉積時(shí)間對電化學(xué)信號(hào)的影響。電流響應(yīng)隨沉 積時(shí)間的增加而迅速增大。然而，由于沉積銅的飽和，當(dāng)沉積時(shí)間大于300秒時(shí)電流沒有明 顯的升高。因此，在以下實(shí)驗(yàn)中Cu 2+分析的沉積時(shí)間確定在300秒。
[0069] 2.4、PSA 的檢測
[0070] 在上述最佳實(shí)驗(yàn)條件下，我們用所建立的方法對10mM PBS中的不同濃度的PSA進(jìn) 行了檢測。將所得的DPSVs表示在圖5A中，從圖中看出，隨著PSA的濃度從0增加到lOOOfg/ mL，電流也逐漸增大（曲線a到m)。圖5B中的滴定曲線顯示，當(dāng)PSA濃度在0.05fg/mL-500fg/ mL范圍內(nèi)，-ΔΙΡ(有PSA和沒有PSA時(shí)峰電流差的負(fù)值）與log(CPSA(fg/mL))呈線性關(guān)系，其 線性方程式為:_Δ 1[^八）=(5.96±0.09) + (3.48±0.08)[1(^^如(邙/1^))]，相關(guān)系數(shù)為 0.995?；谖宕慰瞻讓?shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測量(95%可信度，k = 3，n = 5)，確定PSA的檢測限為 0.020±0.001fg/mL，至少比此前公布的檢測PSA的電化學(xué)方法的檢測限低四個(gè)數(shù)量級。本 方案所設(shè)計(jì)的級聯(lián)信號(hào)放大策略最終實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)生物分析方法的超高靈敏度。
[0071] 2.5、選擇性和重現(xiàn)性
[0072] 為了研究該方法的選擇性，我們對血清樣品中的一些可能與PSA共存的生物分子 進(jìn)行了檢測，包括AFP，CEA，凝血酶和H-IgG。該方法對不同的分析物的電化學(xué)響應(yīng)顯示在圖 6中。很明顯，該檢測方案對于100fg/mL的PSA有顯著的電流響應(yīng)，而對10pg/mL的AFP，CEA， 凝血酶，和H-IgG抗體僅有極輕微的相應(yīng)，表明該方法對PSA的檢測有很好的選擇性。這樣優(yōu) 異的選擇性歸因于anti-PSA和PSA特異性適體對PSA的雙重識(shí)別。
[0073] 為了研究該方法的重復(fù)性，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了五個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，并且被檢 測的PSA濃度也相同。結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.8 %，證明該實(shí)驗(yàn)方法有良好的重現(xiàn)性。 [0074] 2.6、實(shí)際樣品分析
[0075]我們通過分析臨床上人血清樣品中PSA的含量對該方法的實(shí)用性進(jìn)行了評價(jià)。人 血清樣品從齊魯醫(yī)院獲得。由于這些血清樣品中PSA的濃度遠(yuǎn)超出所建立方法的線性范圍， 所以在檢測之前需要適當(dāng)稀釋。該方法的檢測結(jié)果與醫(yī)院提供的使用Cobas6000分析系統(tǒng) 的電化學(xué)發(fā)光免疫測定法(ECLIA方法)得到的數(shù)據(jù)相比較，相對偏差低于6% (表1)，表明該 方法在臨床應(yīng)用中的潛力。
[0076]表1.該方法和ECLIA方法對臨床人類血清樣本的檢測結(jié)果比較。
[0077]
[0078] 3、結(jié)論
[0079]在本研究工作中，我們第一次嘗試將RCA反應(yīng)和單鏈DNA為模板的CuNPs合成方法 相結(jié)合，用于電化學(xué)生物分析的級聯(lián)信號(hào)放大。作為概念驗(yàn)證，我們以PSA為模型目標(biāo)物開 發(fā)了一種超靈敏、高選擇性、低成本的電化學(xué)檢測方法。其中，引物-金納米粒子-適配體/ PSA/anti-PSA夾心結(jié)構(gòu)的形成觸發(fā)了有效的RCA反應(yīng)。CuNPs在RCA產(chǎn)物上的直接形成保證 了級聯(lián)信號(hào)放大的簡單性。另外，使用的引物-金納米粒子-適配體的生物共輒體使信號(hào)增 強(qiáng)了約七倍。最后，通過使用靈敏的DPSV來檢測以RCA產(chǎn)物為模板的CuNPs釋放的銅離子，以 實(shí)現(xiàn)對PSA更為靈敏的檢測。該方法的線性范圍為0.05fg/mL-500fg/mL，檢測限為0.020 土 0.001fg/mL PSA。更重要的是，該方法被證實(shí)可以在臨床檢測中應(yīng)用。此外，通過使用相應(yīng) 的親和配體，該方法可以擴(kuò)展到其它多種疾病標(biāo)志物的檢測中，在疾病診斷方面具有巨大 的潛力。
[0080]上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范 圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 以滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物為模板合成的銅納米顆粒CuNPs在電化學(xué)檢測癌癥標(biāo)志物中的 應(yīng)用。2. 以滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物為模板合成的銅納米顆粒CuNPs在電化學(xué)生物分析中的應(yīng)用。3. 以滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物為模板合成的銅納米顆粒CuNPs在電化學(xué)檢測人類前列腺特異 性抗原PSA中的應(yīng)用。4. 一種基于DNA模板化的CuNPs電化學(xué)檢測癌癥標(biāo)志物的方法，其特征在于， 構(gòu)建能夠與環(huán)狀模板雜交并觸發(fā)RCA反應(yīng)的"primer-AuNP-aptamer/抗原/抗體"三明 治結(jié)構(gòu)； 引發(fā)了RCA反應(yīng)，形成一個(gè)包含連續(xù)多個(gè)胸腺嘧啶的串聯(lián)重復(fù)序列單鏈DNA; 合成CuNPs; 溶解上述CuNPs，以電化學(xué)方法檢測Cu+含量； 根據(jù)Cu+與癌癥標(biāo)志物含量的對應(yīng)關(guān)系，確定待測液中癌癥標(biāo)志物的含量。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述"卩1'；[11161-411即-3卩丨311161'/抗原/抗體"三 明治結(jié)構(gòu)由pr imer-AuNP-aptamer生物共輒體與相應(yīng)的抗體、抗原特異結(jié)合而成。6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述primer-AuNP-aptamer生物共輒體能夠 特異性識(shí)別相應(yīng)的癌癥抗原或癌癥標(biāo)志物并且形成三明治夾心結(jié)構(gòu)。7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述primer-AuNP-aptamer生物共輒體通過 金納米粒子AuNPs和DNA序列間的Au-S鍵結(jié)合。8. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述金納米粒子AuNP作為載體增加了引物/ 適體的比例，從而放大信號(hào)。9. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在T4連接酶和環(huán)狀模板DNA存在的情況下， primer-AuNP-aptamer生物共輒體中的引物可以與環(huán)狀模板進(jìn)行雜交并且在phi29DNA聚合 酶的協(xié)助下進(jìn)一步觸發(fā)RCA反應(yīng)。10. -種基于DNA模板化的CuNPs電化學(xué)檢測人類前列腺特異性抗原PSA的方法，其特征 在于， 構(gòu)建能夠與環(huán)狀模板雜交并觸發(fā)RCA反應(yīng)的"引物primer-納米金AuNP-適配體 aptamer/PSA/PSA 抗體 anti-PSA" 三明治結(jié)構(gòu)； 引發(fā)了RCA反應(yīng)，形成一個(gè)包含連續(xù)多個(gè)胸腺嘧啶的串聯(lián)重復(fù)序列單鏈DNA; 合成CuNPs; 溶解上述CuNPs，以電化學(xué)方法檢測Cu+含量； 根據(jù)Cu+與PSA含量的對應(yīng)關(guān)系，確定待測液中PSA的含量。
【專利摘要】本發(fā)明提供了滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的銅納米顆粒合成方法及其在電化學(xué)檢測中的應(yīng)用。選用前列腺特異抗原(PSA)為模型目標(biāo)分子。引物-納米金-適配體/PSA/PSA抗體夾心結(jié)構(gòu)的構(gòu)建引發(fā)了滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，從而生成成千上萬的聚胸腺嘧啶重復(fù)序列，以作為合成銅納米顆粒的模板；進(jìn)一步對形成的銅納米顆粒用硝酸進(jìn)行溶解，并用電化學(xué)方法對溶解得到的銅離子進(jìn)行檢測，最終實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物PSA含量的確定。得益于所設(shè)計(jì)的信號(hào)級聯(lián)放大策略，本方法檢測PSA的線性范圍為0.05fg/mL-500fg/mL，檢測限為0.020±0.001fg/mL？PSA。最終，我們通過檢測臨床血清樣品中的PSA含量對本方法的可實(shí)用性進(jìn)行了驗(yàn)證。本方法的超靈敏度、特異性、以及檢測實(shí)際樣品的能力使其在疾病診斷應(yīng)用中展示了巨大潛力。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105567808
【申請?zhí)枴緾N201510969074
【發(fā)明人】朱燁, 王慧娟, 朱靜
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月21日