[0050]b.如待檢燕窩制品未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，無Ct值，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照都成立，則可判定該待檢燕窩制品未檢出燕窩成分。
[0051]c.如待測(cè)待檢燕窩制品Ct值在35-40之間，應(yīng)重作實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小于35，且陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果都成立，則可判定該待檢燕窩制品檢出燕窩成分；再次擴(kuò)增后的結(jié)果為無擴(kuò)增曲線無Ct值，且陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果都成立，則可判定該待檢燕窩制品未檢出燕窩成分。
【附圖說明】
[0052]圖1為本發(fā)明的流程圖；
[0053]圖2為本發(fā)明具體實(shí)施I中真核生物18SrRNA基因的擴(kuò)增圖譜；
[0054]圖3為本發(fā)明具體實(shí)施I中金絲燕12S rRNA基因的擴(kuò)增圖譜；
[0055]圖4為本發(fā)明具體實(shí)施2中真核生物18S rRNA基因的擴(kuò)增圖譜；
[0056]圖5為本發(fā)明具體實(shí)施2中金絲燕12S rRNA基因的擴(kuò)增圖譜；
【具體實(shí)施方式】
[0057]為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0058]參見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5，一種燕窩制品實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定方法，包括如下步驟:步驟一，待檢燕窩制品DNA的提取；步驟二，金絲燕成分實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；首先，在PCR反應(yīng)管中加入2XPCR Master Mix 12.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5-1 μ L，Taqman探針0.5-1 μ L，50ng/ μ L待檢燕窩制品DNA1-2 μ L，補(bǔ)充雙蒸水至25 μ L，混勻；其次，將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增:a.94-95°C 5min，I個(gè)循環(huán)，預(yù)變性；b.94-95°C 10-20sec ；60°C 20_40sec，40個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增；步驟三，使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀分析軟件分析擴(kuò)增結(jié)果。本發(fā)明的主要原理是燕窩主要來自金絲燕的唾液，里面含有金絲燕的DNA，通過檢測(cè)燕窩中的金絲燕12S rRNA基因來鑒別燕窩的真假。如果燕窩制品中能檢出金絲燕特異性12S rRNA基因，則待檢燕窩制品為真燕窩；如果未檢出金絲燕特異性12S rRNA基因，說明待檢燕窩制品為假冒燕窩。本發(fā)明特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)，簡(jiǎn)單快速，整個(gè)檢測(cè)過程只需要3?4小時(shí)。
[0059]步驟一中，待檢燕窩制品DNA的提取可以采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。在步驟二與步驟三之間，進(jìn)行DNA濃度的測(cè)定，將DNA濃度調(diào)整為50ng/ μ L，首先使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取待檢燕窩制品DNA的吸光值Α260和Α280，其Α260/Α280比值在1.7?2.0之間，按以下公式計(jì)算DNA濃度:C = A*N*50 ;其中C一DNA濃度，單位為ng/ μ L ；A—260nm處的吸光值；N—DNA稀釋倍數(shù)；將DNA濃度稀釋到50ng/ μ L0通過特異性擴(kuò)增金絲燕的12S rRNA基因序列對(duì)燕窩進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增的DNA片段大小為144bp。
[0060]步驟二中，擴(kuò)增金絲燕的特異性12S rRNA序列的引物，序列如下:
[0061]上游引物:5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’ ；
[0062]下游引物:5’ -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3 ’ ；
[0063]TaqMan 探針序列:5’ -CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3’，其中 5’ 端標(biāo)記 FAM報(bào)告熒光集團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光基團(tuán)。在應(yīng)用中，上游引物、下游引物、TaqMan探針的濃度為10 ymol/Lo
[0064]本發(fā)明根據(jù)金絲燕的12S rRNA基因特異性序列設(shè)計(jì)一對(duì)組引物(上游引物SffT-F:5’ -GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’ 和下游引物 SWT_R:5’ -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3 ’)和一條 Taqman 探針(探針 SWT-P 序列為:5 ’ -FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3’)。進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí)，模板DNA經(jīng)加熱至94?95°C—定時(shí)間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模板特異性結(jié)合。探針的5端標(biāo)記有報(bào)告熒光集團(tuán)，3端有淬滅熒光集團(tuán)，當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告集團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅集團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結(jié)合的探針時(shí)，其3’ 一5’外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告集團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。隨著PCR循環(huán)的增加，目的片段成指數(shù)增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也同步增強(qiáng)，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱直接反應(yīng)模板數(shù)量。
[0065]本發(fā)明對(duì)待檢燕窩制品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，每個(gè)待檢燕窩制品同時(shí)做兩個(gè)平行。
[0066]步驟二中，對(duì)金絲燕成分實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)設(shè)立三個(gè)對(duì)照:陽性對(duì)照(金絲燕基因組DNA)、陰性對(duì)照(非金絲燕基因組DNA)、空白對(duì)照(不含DNA模板，可以水代替)；并且，同時(shí)擴(kuò)增真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因。步驟二中，同時(shí)檢測(cè)真核生物18S rRNA基因以判斷是否從待檢燕窩制品中提取適宜進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的DNA或提取的DNA中是否存在PCR反應(yīng)抑制因子；步驟二中，分別配置真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因的上游引物、下游引物和Taqman探針。本發(fā)明涉及的真核生物18S rRNA基因引物和探針序列參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 25165-2010《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法》:
[0067](I)上游引物 18S-F:5’ -CCTGAGAAACGGCTACCAC-3’ ；
[0068](2)下游引物 18S-R:5，-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3，；
[0069](3) TaqMan 探針 18S-P:5’ -TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3’，其 5’ 端標(biāo)記 FAM 報(bào)告熒光集團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光基團(tuán)。
[0070]步驟三，分析擴(kuò)增結(jié)果時(shí)，應(yīng)設(shè)置的各種對(duì)照實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)全部符合以下情況，否則應(yīng)重做實(shí)驗(yàn):
[0071]a.陽性對(duì)照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值小于30 ;
[0072]b.陰性對(duì)照的真核生物18S rRNA基因出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值小于30，金絲燕12SrRNA基因未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值彡40 ；
[0073]c.空白對(duì)照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值Ct值彡40。
[0074]此外，待檢燕窩制品的真核生物18S rRNA基因?qū)崟r(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果Ct值應(yīng)小于30，否則重新提取DNA。
[0075]只有在滿足以上兩種情況下，判斷待檢燕窩制品是否含有燕窩成品，判斷方法如下:
[0076]a.如待檢燕窩制品出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，且Ct值小于或等于35，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果都成立(即陽性待檢燕窩制品出現(xiàn)典型陽性擴(kuò)增曲線，陰性待檢燕窩制品盒空白對(duì)照無擴(kuò)增)，則可判定該待檢燕窩制品檢測(cè)出燕窩成分；
[0077]b.如待檢燕窩制品未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，無Ct值，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照都成立，則可判定該待檢燕窩制品未檢出燕窩成分。
[0078]c.如待測(cè)待檢燕窩制品Ct值在35-40之間，應(yīng)重作實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小于35，且陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果都成立，則可判定該待檢燕窩制品檢出燕窩成分；再次擴(kuò)增后的結(jié)果為無擴(kuò)增曲線無Ct值，且陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果都成立，則可判定該待檢燕窩制品未檢出燕窩成分。
[0079]具體實(shí)施1:
[0080]待檢燕窩制品為某品牌燕窩，購(gòu)于大型超市
[0081]步驟一，DNA提??；
[0082]A.稱取待檢燕窩制品，粉碎后取0.3g，加至2ml離心管中，加入900 μ L預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液和40 μ L蛋白酶K，輕輕混勻后，65°C水域保溫60min，加入5 μ L RNA酶溶液，37 cC 30min ；
[0083]B.2000g離心5min，取上清于另一干凈的2ml離心管中，加入等體積的酚，三氯甲烷和異戊醇的混合液(25:24:1)，震蕩混勻；
[0084]C.12000g離心lOmin，取上清至干