滿足要求；
[0144]E.待檢燕窩制品的金絲燕12S rRNA基因?qū)崟rPCR檢測結(jié)果出現(xiàn)擴增曲線，Ct值17.76和17.70，據(jù)此可判定該待檢燕窩制品檢出燕窩成分。
[0145]步驟二中混勻采用的裝置可以是一震動裝置，震動裝置包括一殼體，殼體內(nèi)設(shè)有一中空腔體，中空腔體的下方設(shè)有至少一個超聲波發(fā)生器，超聲波發(fā)生器的發(fā)射方向朝向中空腔體，殼體內(nèi)還設(shè)有一攪拌裝置。
[0146]攪拌裝置連接一微型處理器系統(tǒng)，微型處理器系統(tǒng)連接一時鐘模塊，微型處理器系統(tǒng)還連接一超聲波發(fā)生器。
[0147]殼體的下端部設(shè)有一腔室，腔室的下端面上設(shè)有超聲波發(fā)生器，腔室的上端面固定連接中空腔體的下端面。腔室的側(cè)壁上設(shè)有透氣孔，透氣孔均勻分布于腔室的側(cè)壁上。本發(fā)明通過超聲波發(fā)生器通過腔室實現(xiàn)超聲波震動的傳遞，從而提高了對中空腔體下端面的震動均勻性。
[0148]步驟二中，混勻時，首先攪拌裝置工作3分鐘后，進(jìn)行超聲波發(fā)生器工作I分鐘，最后攪拌裝置與超聲波發(fā)生器共同工作2分鐘。通過攪拌裝置與超聲波發(fā)生器的結(jié)合，從而提高溶質(zhì)的溶解度，提高待測溶液的測試精度。首先進(jìn)行攪拌后，通過超聲波發(fā)生器消除因攪拌而產(chǎn)生的氣泡。
[0149]步驟一，DNA提取時，稱取待檢燕窩制品，粉碎后取0.3g，加至2ml試管中，加入900 μ L預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液和40 μ L蛋白酶K，采用震動裝置混勻后，65 V水域保溫60min，加入 5 μ L RNA 酶溶液，37 °C 30min。
[0150]步驟一中，混勻時，首先攪拌裝置工作2分鐘后，進(jìn)行超聲波發(fā)生器工作2分鐘，最后攪拌裝置與超聲波發(fā)生器共同工作I分鐘。通過攪拌裝置與超聲波發(fā)生器的結(jié)合，從而提高溶質(zhì)的溶解度，提高待測溶液的測試精度。首先進(jìn)行攪拌后，通過超聲波發(fā)生器消除因攪拌而產(chǎn)生的氣泡。
[0151]攪拌裝置包括兩個相互嚙合的齒輪，齒輪包括雙層，分別為內(nèi)層與外層，內(nèi)層的硬度大于外層的硬度。本發(fā)明通過兩個相互嚙合的齒輪進(jìn)行聯(lián)動，從而提高攪拌效果。齒輪同步轉(zhuǎn)動的轉(zhuǎn)速不小于3000轉(zhuǎn)/分鐘。從而保證攪拌效果。外層包覆在內(nèi)層的外壁上。
[0152]震動裝置包括一進(jìn)料端、一出料端，進(jìn)料端與兩個所述齒輪的連接處的上端聯(lián)通，出料端與所述兩個齒輪的連接處的下端聯(lián)通，出料端位于中空腔體的底部。
[0153]殼體的內(nèi)壁上設(shè)有與齒輪相嚙合的弧狀突起。從而提高攪拌效果，消除殼體內(nèi)的攪拌死角。
[0154]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【主權(quán)項】
1.一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，待檢燕窩制品DNA的提??； 步驟二，金絲燕成分實時熒光PCR擴增； 首先，在PCR反應(yīng)管中加入2XPCR Master Mix 12.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5-1 μ L，Taqman 探針 0.5-1 μ L，50ng/μ L 待檢燕窩制品 DNA1-2 μ L，補充雙蒸水至 25 μ L，混勻； 其次，將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴增: a.94-95 °C 5min，I個循環(huán)，預(yù)變性；b.94-950C 10-20sec ；60°C 20_40sec，40 個循環(huán)，PCR 擴增； 步驟三，使用實時熒光PCR儀分析軟件分析擴增結(jié)果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，通過特異性擴增金絲燕的12S rRNA基因序列對燕窩進(jìn)行鑒定，擴增的DNA片段大小為144bp。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，步驟二中，擴增金絲燕12S rRNA基因的上游引物、下游引物、TaqMan探針的序列如下: 上游引物序列:5’ -GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’ 下游引物序列:5’ -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’ ； TaqMan探針序列:5，-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3，， 其中5’端標(biāo)記FAM報告熒光集團，3’端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光基團。4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，步驟二中，對金絲燕成分實時熒光PCR擴增時，應(yīng)設(shè)立三個對照:陽性對照:金絲燕基因組DNA、陰性對照:非金絲燕基因組DNA、空白對照:不含DNA模板； 并且，同時擴增真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，步驟二中，分別配置真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因的上游引物、下游引物和Taqman 探針。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，步驟三，分析擴增結(jié)果時，應(yīng)設(shè)置的各種對照實時PCR檢測結(jié)果應(yīng)全部符合以下情況，否則應(yīng)重做實驗: a.陽性對照的真核生物18SrRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都出現(xiàn)擴增曲線，Ct值小于30 ; b.陰性對照的真核生物18SrRNA基因出現(xiàn)擴增曲線，Ct值小于30，金絲燕12S rRNA基因未出現(xiàn)擴增曲線，Ct值多40 ; c.空白對照的真核生物18SrRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都未出現(xiàn)擴增曲線，Ct值Ct值多40。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，待檢燕窩制品的真核生物18S rRNA基因?qū)崟rPCR檢測結(jié)果Ct值應(yīng)小于30，否則重新提取DNA。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，判斷待檢燕窩制品是否含有燕窩成品，判斷方法如下: a.如待檢燕窩制品出現(xiàn)擴增曲線，且Ct值小于或等于35，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果都成立(即陽性待檢燕窩制品出現(xiàn)典型陽性擴增曲線，陰性待檢燕窩制品盒空白對照無擴增)，則判定該待檢燕窩制品檢測出燕窩成分； b.如待檢燕窩制品未出現(xiàn)擴增曲線，無Ct值，陰性對照、陽性對照和空白對照都成立，則判定該待檢燕窩制品未檢出燕窩成分； c.如待測待檢燕窩制品Ct值在35-40之間，應(yīng)重作實時熒光PCR擴增，再次擴增后的結(jié)果Ct值仍小于35，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果都成立，則可判定該待檢燕窩制品檢出燕窩成分；再次擴增后的結(jié)果為無擴增曲線無Ct值，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果都成立，則可判定該待檢燕窩制品未檢出燕窩成分。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，步驟一中，待檢燕窩制品DNA的提取采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，在步驟二與步驟三之間，進(jìn)行DNA濃度的測定，將DNA濃度調(diào)整為50ng/ μ L，首先使用紫外分光光度計檢測提取待檢燕窩制品DNA的吸光值A(chǔ)260和A280，其A260/A280比值在1.7?2.0之間，按以下公式計算DNA濃度:C = A*N*50 ； 其中C一 DNA濃度，單位為ng/ μ L ; A — 260nm處的吸光值； N-DNA稀釋倍數(shù)； 將DNA濃度稀釋到50ng/ μ L0
【專利摘要】本發(fā)明涉及化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，包括如下步驟：步驟一，待檢燕窩制品DNA的提?。徊襟E二，金絲燕成分實時熒光PCR擴增；首先，在PCR反應(yīng)管中加入2×PCR？Master？Mix？12.5μL，上游引物和下游引物各0.5-1μL，Taqman探針0.5-1μL，50ng/μL待檢燕窩制品DNA1-2μL，補充雙蒸水至25μL，混勻；其次，將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀完成PCR擴增；步驟三，使用實時熒光PCR儀分析軟件分析擴增結(jié)果。本發(fā)明的主要原理是燕窩主要來自金絲燕的唾液，里面含有金絲燕的DNA，通過檢測燕窩中的金絲燕12S？rRNA基因來鑒別燕窩的真假。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105586397
【申請?zhí)枴緾N201510349675
【發(fā)明人】趙玉簪
【申請人】英格爾檢測技術(shù)服務(wù)（上海）有限公司, 趙玉簪
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2015年6月19日