凈的2ml離心管中，加入等體積的三氯甲烷和異戊醇的混合液(24:1)，顛倒混勻；
[0085]D.12000g離心lOmin，取上清至干凈的2ml離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻；
[0086]E.12000g離心lOmin，棄去上清液，用4°C預(yù)冷的70%乙醇500 μ L，渦旋清洗沉淀；
[0087]F.12000g離心lOmin，棄去上清液，倒置曬干后加100 μ L TE緩沖液溶解沉淀，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0088]步驟二，DNA濃度和純度的測定
[0089]提取到DNA 的 A260/A280 比值為 1.84，DNA 濃度為 154ng/ μ L，稀釋到 50ng/ μ L。
[0090]步驟三，待檢燕窩制品中金絲燕成分實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增；
[0091]A.配置真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因引物和探針:
[0092]a.真核生物18S rRNA基因
[0093]上游引物18S-F:5’ -CCTGAGAAACGGCTACCAC-3’，濃度 10 μ mol/L ；
[0094]下游引物18S-R:5’ -CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’，濃度 10 μ mol/L ；
[0095]TaqMan 探針 18S-P:5’ -FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA-3，，濃度 10 μ mol/L。
[0096]b.金絲燕12S rRNA基因
[0097]上游引物SWT-F:5’ -GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’，濃度 10 μ mol/L ；
[0098]下游引物SWT-R:5，-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3，，濃度 10 μ mol/L ;
[0099]Taqman 探針 SWT-P: 5，-FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3，，濃度10 μmol/L。
[0100]B.在PCR反應(yīng)管中加入2XPCR Master Mix 12.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5 μ L，Taqman探針0.5 μ L，50ng/ μ L待測待檢燕窩制品的DNA 2 μ L，補(bǔ)充雙蒸水至25 μ L，混勻；
[0101]C.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增:
[0102]95 °C 2min，I個循環(huán)，預(yù)變性；
[0103]950C 15sec ；60°C 40sec，45 個循環(huán)，PCR 擴(kuò)增。
[0104](4)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機(jī)軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果:參見圖2和圖3，
[0105]A.陽性對照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值分別為15.45和16.15，滿足要求；
[0106]B.陰性對照的真核生物18S rRNA基因出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值為18.09(見圖1);金絲燕12S rRNA基因未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值彡40，滿足要求；
[0107]C.空白對照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值Ct值彡40，滿足要求；
[0108]D.待檢燕窩制品的真核生物18S rRNA基因?qū)崟rPCR檢測結(jié)果出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值為17.75和16.93，滿足要求；
[0109]E.待檢燕窩制品的金絲燕12S rRNA基因?qū)崟rPCR檢測結(jié)果出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值15.25和15.10，據(jù)此可判定該待檢燕窩制品檢出燕窩成分。
[0110]具體實(shí)施2
[0111]待檢燕窩制品為某品牌冰糖燕窩，購于大型超市
[0112]步驟一，DNA提??；
[0113]A.取待檢燕窩制品(冰糖燕窩)5g至50mL離心管中，12000g離心lOmin，棄去上清，加入1mL預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液和40 μ L蛋白酶K，輕輕混勻后，65 °C水浴保溫45min ；
[0114]B.12000g離心5min，取上清于另一干凈的50ml離心管中，加入等體積的酸，三氯甲烷和異戊醇的混合液(25:24:1)，震蕩混勻；
[0115]C.12000g離心5min，取上清至干凈的2ml離心管中，加入等體積的三氯甲烷和異戊醇的混合液(24:1)，顛倒混勻；
[0116]D.12000g離心5min，取上清至干凈的2ml離心管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻；
[0117]E.4°C下12000g離心lOmin，棄去上清液，用4°C預(yù)冷的70 %乙醇800 μ L，清洗沉淀；
[0118]F.12000g離心5min，棄去上清液，加入20 μ L RNA酶溶液，37°C溫育30min ；
[0119]G.加入600 μ L氯化鈉溶液，65°C溫浴1min ;加入600 μ L的的三氯甲烷和異戊醇的混合液(24:1)，震蕩混勻；12000g離心5min，取上清至干凈的1.5ml離心管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻；
[0120]H.4°C下12000g離心lOmin，棄去上清液，用4°C預(yù)冷的70%乙醇500 μ L，清洗沉淀；
[0121]1.12000g離心5min，小心棄去上清，用4°C預(yù)冷的70%乙醇重復(fù)洗一遍；
[0122]J.室溫下?lián)]發(fā)剩余液體；加入50 μ L的TE緩沖液溶解DNA，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0123]步驟二，DNA濃度和純度的測定；
[0124]提取到DNA 的 A260/A280 比值為 1.75，DNA 濃度為 63ng/ μ L，稀釋到 50ng/ μ L0
[0125]步驟三，待檢燕窩制品中金絲燕成分實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增
[0126]Α.配置真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因引物和探針:
[0127]a.真核生物18S rRNA基因
[0128]上游引物18S-F:5’ -CCTGAGAAACGGCTACCAC-3 ’，濃度 10 ymol/L ；
[0129]下游引物18S-R:5’ -CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3 ’，濃度 10 ymol/L ；
[0130]TaqMan 探針 18S-P:5’ -FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA-3，，濃度 10 μ mol/L。
[0131]b.金絲燕12S rRNA基因
[0132]上游引物SWT-F:5’ -GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’，濃度 10 μ mol/L ;
[0133]下游引物SWT-R:5’ -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’，濃度 10 μ mol/L ;
[0134]Taqman 探針 SWT-P: 5，-FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3，，濃度10 μmol/L。
[0135]B.在PCR反應(yīng)管中加入2XPCR Master Mix 12.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5 μ L，Taqman探針0.5 μ L，50ng/ μ L待測待檢燕窩制品的DNA 2 μ L，補(bǔ)充雙蒸水至
25μ L，混勻；
[0136]C.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增:
[0137]95 °C 2min，I個循環(huán)，預(yù)變性；
[0138]950C 15sec ；60°C 40sec，45 個循環(huán)，PCR 擴(kuò)增。
[0139](4)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機(jī)軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果:參見圖4和圖5，
[0140]A.陽性對照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值分別為16.83和17.67，滿足要求；
[0141]B.陰性對照的真核生物18S rRNA基因出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值為16.74 ;金絲燕12SrRNA基因未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值多40，滿足要求；
[0142]C.空白對照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值Ct值彡40，滿足要求；
[0143]D.待檢燕窩制品的真核生物18S rRNA基因?qū)崟rPCR檢測結(jié)果出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值為16.78和16.82，