多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，具體地涉及該多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方 法在低拷貝數(shù)量、高度復(fù)雜模板中高效及精準(zhǔn)擴(kuò)增目的核酸序列的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[000引聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)能夠W少量DNA為模板，并將目標(biāo)DNA片段在短時(shí)間（幾 小時(shí)）內(nèi)W指數(shù)擴(kuò)增的方式大量富集。多重PCR可W在一個(gè)反應(yīng)中對多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò) 增，與常規(guī)PCR技術(shù)相比具有高效、省時(shí)、省樣本等優(yōu)勢，因此該技術(shù)已成為臨床和基礎(chǔ)研 究中一種快捷簡便的基因檢測方法。然而，由于在多重PCR反應(yīng)體系中，高濃度的多種引物 間會(huì)發(fā)生相互作用，嚴(yán)重影響了擴(kuò)增的特異性和均一性，并導(dǎo)致擴(kuò)增靈敏度和產(chǎn)量的降低。 送些問題大大限制了多重PCR的應(yīng)用。
[0003] 目前，解決送個(gè)問題的傳統(tǒng)方法有；使用特殊的軟件來設(shè)計(jì)多重PCR的引物 (如 MPprimer 等）、優(yōu)化反應(yīng)組分和熱循環(huán)條件（Markoulatos, P. , Siafakas, N. , Monc any, M. Multiplex polymerase chain reaction:A practical approach. [J]. Journal of Clinical Laboratory Analysis. , 2002, 16:47-51 ;Henegariu, 0. , Heerema, N. A.，Dlouhy, S.民.，et al. Multiplex PC民：Critical parameters and step-by-step protocol [J]. Biotechniques，1997, 23:504-511)。傳統(tǒng)方法主要依賴大量的條件摸索和經(jīng) 驗(yàn)的積累。除了基于經(jīng)驗(yàn)的傳統(tǒng)方法外，已有幾種巧妙的策略來提高多重PCR的特異性。例 女口；利用復(fù)合引物（compositied primers)與巢式PCR相結(jié)合的策略也能較好的改善多重 PCR的特異性和產(chǎn)量的問題扣S2009/0253183 AUUS 2010/0291668 Al)。送一策略在引物 設(shè)計(jì)時(shí)，將一段序列完全相同的引物加入到每一個(gè)特異性引物的5'端（通用序列），從而組 成復(fù)合引物。送一序列完全相同的引物稱為通用引物（common primer)，它的序列與待擴(kuò)增 的模板不具有同源性。每一個(gè)復(fù)合引物由兩部分組成：靠近5'端的通用引物和靠近3'的 特異引物。在第一輪擴(kuò)增中，復(fù)合引物中只有特異性序列的能與模板配對并擴(kuò)增，因此第一 輪擴(kuò)增能將各DNA目標(biāo)片段擴(kuò)增出來；此外，由于每個(gè)特異引物的末端都附加有一段通用 引物的序列，因此在每一個(gè)擴(kuò)增的產(chǎn)物的兩端都具有相同的序列。在第二輪擴(kuò)增中，只需加 入一種序列（通用引物）即可完成所有目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增。此外，在引物合成是加入非天然 的人工堿基也能明顯改善多重PCR的特異性。也有人報(bào)道稱在多重PCR中引入一種單鏈結(jié) 合蛋白RecA也能改善多重PCR的特異性。
[0004] 然而，上述對多重PCR的改進(jìn)方法都有一定缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的優(yōu)化方法依賴大量的實(shí) 驗(yàn)來優(yōu)化反應(yīng)條件，且在不同的擴(kuò)增體系下最佳的優(yōu)化條件需要重新優(yōu)化，需要耗費(fèi)大量 的時(shí)間和試劑。利用通用引物和巢式PCR的策略的實(shí)驗(yàn)較簡單且效果較好，但送一策略需 要保證通用引物的序列與DNA模板無同源性，送增加了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的難度；巢式PCR需要將 第一輪產(chǎn)物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，送增大了實(shí)驗(yàn)室交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，在第一輪擴(kuò)增中引物 仍然可能因相互作用而產(chǎn)生非特異擴(kuò)增，特異性的降低和擴(kuò)增非均一性的問題仍然難W避 免。綜上所述，上述多重PCR的優(yōu)化策略會(huì)有優(yōu)化過程復(fù)雜、需要特殊儀器、費(fèi)用昂貴等問 題。
[000引本質(zhì)上，多重PCR的問題主要是因大量不同序列的引物之間的相互干擾和競爭引 起。送些相互作用會(huì)導(dǎo)致引物二聚體、引物與模板錯(cuò)配等，進(jìn)而導(dǎo)致非特異產(chǎn)物。由于在PCR 過程中，送些非特異擴(kuò)增與特異性擴(kuò)增競爭PCR反應(yīng)底物，減少了特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量，導(dǎo)致 靈敏度低的問題。送些問題極大的降低了基于多重PCR的檢測方法的特異性和靈敏度。因 此，從引物的相互作用角度出發(fā)對PCR體系進(jìn)行改進(jìn)，使得PCR具有一種能選擇性抑巧排特 異擴(kuò)增、增強(qiáng)特異性擴(kuò)增的能力就可W有效提高多重PCR的特異性和靈敏度；此外，從實(shí)際 應(yīng)用的角度出發(fā)，建立一種操作簡單、廉價(jià)且具有廣泛適用性的多重PCR改進(jìn)方法是十分 重要的。
[0006] 近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，許多納米材料已被用于PCR的優(yōu)化，如納米金、納 米銀、量子點(diǎn)、納米多聚物和納米碳材料等。送些材料可不能程度的改善PCR中出現(xiàn)的各種 問題，但各類材料優(yōu)化效果各有不同，且只是對常規(guī)PCR(單重PCR)的優(yōu)化。氧化的石墨帰 材料是種新型的二維碳材料，具有比表面積大、導(dǎo)熱性良好等性質(zhì)。目前，人們已發(fā)現(xiàn)氧化 石墨帰能吸附DNA (單鏈DNA和雙鏈）；此外，氧化石墨帰能有效降低含有錯(cuò)配的單鏈DNA的 配對效率。因此氧化石墨帰的特異性能很好的選擇性抑制非特異配對和擴(kuò)增，從而提高多 重PCR的特異性和靈敏度。送種方法不需要對各個(gè)引物對進(jìn)行特殊的設(shè)計(jì)，也無需進(jìn)行容 易導(dǎo)致污染的二次擴(kuò)增，可W大大簡化實(shí)驗(yàn)流程和降低交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，大規(guī)模生產(chǎn) 分散均勻的氧化石墨帰水溶液的制備方法成熟，成本低廉。因此，利用氧化石墨帰作為添加 劑優(yōu)化多重PCR可建立一種操作簡單、低成本且具有廣泛適用性的多重PCR優(yōu)化策略。目 前，未見報(bào)道將氧化石墨帰用于多重PCR技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種氧化石墨帰在多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中作為優(yōu)化劑和增 強(qiáng)特性劑的應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，包括步驟：
[0009] (A)提供一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，所述反應(yīng)體系含有待擴(kuò)增的模板、用于擴(kuò)增的引 物對、聚合酶、氧化石墨帰和用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需的試劑；
[0010] 度）對上一步驟的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而獲得含擴(kuò)增產(chǎn) 物的反應(yīng)混合物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物包括分別對應(yīng)于所述引物對的各擴(kuò)增產(chǎn)物；和
[0011] (C)任選地，對上一步驟中的反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳和/或測序檢測，
[0012] 其中，所述的用于擴(kuò)增的引物對包括3-30個(gè)引物對。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中，氧化石墨帰的含量為100 -50化g/25微升；較佳地150 - 40化g/25微升；較佳地200 - 30化g/25微升。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，各引物對中上游引物與下游引物之比為約0. 8-1. 2 ;0. 8-1. 2， 較佳地為約1:1。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中，氧化石墨帰的含量與所述代擴(kuò)增 模板的含量之比為；100-500ng ;5-25ng ;較佳地 150-400ng ;5-25ng ;更佳地 200-300ng ; 5-25ng。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中，所述模板的濃度為0.1 -Wng/微 升，較佳地為0. 5-5ng/微升，更佳地為0. 8-化g/微升（如約lng/微升）。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的模板為哺乳動(dòng)物的總DNA。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，步驟度）中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度為Tf±5°C，較佳地為 T平均±3。其中T平均為所有引物的Tm的算術(shù)平均值。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，步驟度）中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度為45-7(TC，較佳地為 約 50〇C。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，在適量氧化石墨帰存在下，所述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中W同 樣的退火溫度或氧化石墨帰濃度在低拷貝模板的條件下能擴(kuò)增出全部特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的"低拷貝模板"指反應(yīng)體系中模板的總含量《5ng，較佳 地《化g，更佳地《Ing。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的模板包括抽提的基因組DNA模板、抽提的RNA模板、或 CDNA模板。更佳地，所述的模板包括抽提的全基因組DNA模板。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中引物對不需要特殊設(shè)計(jì)。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中不含氧化石墨帰時(shí)（作為對照）， 在任意退火溫度下，W人類基因組為模板不能擴(kuò)增出全部特異性產(chǎn)物。
[00巧]在另一優(yōu)選例中，所述的模板為人基因組DNA，且引物對包括7或8個(gè)引物對，并且 在一定的退火溫度下，所述方法擴(kuò)增出全部（即7或8個(gè)）特異性產(chǎn)物。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中用于擴(kuò)增的引物對包括3-15個(gè) 引物對，較佳地5-10對，更佳地6-9個(gè)引物對。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)不僅擴(kuò)增出全部特異性產(chǎn)物并且抑 制了引物二聚體和其它非特異性產(chǎn)物的形成。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，在擴(kuò)增后的反應(yīng)混合物中，所述的引物二聚體的數(shù)量少于總擴(kuò) 增產(chǎn)物量的5% -10%
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的氧化石墨帰能抑制引物對中只含有一個(gè)錯(cuò)配堿基的非特 異擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，在所述反應(yīng)體系中，待擴(kuò)增的模板的總量為0. 5-l(K)ng，較佳地 l-50ng。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，待擴(kuò)增的模板的總量為l-5ng或20-4化g。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述模板的總量為Ing或5ng時(shí)，且所述引物對為8個(gè)引物對。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的氧化石墨帰選自下組；通過Hummer法制備的水溶性氧化 石墨帰，其表面帶有駿基、居基、氨基等基團(tuán)。
[0034] 在本發(fā)明的第二方面，提供一種用于多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，所述試劑盒包 含：
[0035] -容器A W及位于所述容器內(nèi)的用于在多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行特異性擴(kuò)增多 種祀序列的3-20引物對；W及
[0036] -容器B W及位于所述容器內(nèi)的氧化石墨帰；和
[0037] 使用說明書。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的容器A和容器B為同一容器。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的容器B包括多個(gè)反應(yīng)管，并且每個(gè)反應(yīng)管中放置了用于 一次多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需用量的氧化石墨帰。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的容器B的體積為50、100、150、200、250、500或1000微升， 而所需用量的氧化石墨帰為100-500微克。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有：
[0042] 一容器C W及位于所述容器內(nèi)的測定所述多種祀序列的試劑或芯片。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的祀序列包括DNA序列和RNA序列。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的容器C