（3)68 °C延伸10分鐘；
[0162] 電泳分析條件：同實(shí)施例1。
[0163] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0164] 對(duì)多重PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。
[0165] M表示DNA marker, A組表示不加氧化石墨帰的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果，B組表示加氧化石 墨帰巧化g)的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果。Nl表示不加模板、不加氧化石墨帰的陰性對(duì)照；其中A1、A2 表示不加入GO的3重?cái)U(kuò)增結(jié)果；N2表示加入GO巧化g)但不加模板的陰性對(duì)照；BK B2組 表示加入50ng氧化石墨帰的3重?cái)U(kuò)增結(jié)果。圖中從下向上產(chǎn)物長度依次為；176bp、203bp 和258bp。由圖4A可見，在不加入氧化石墨帰的條件下進(jìn)行多重PCR，引物間相互作用會(huì)抑 制特異產(chǎn)物的擴(kuò)增，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異產(chǎn)物，導(dǎo)致擴(kuò)增特異性降低、產(chǎn)量低；當(dāng)加入氧化石 墨帰材料時(shí)（圖4B)，特異性顯著提高，3個(gè)特異產(chǎn)物在電泳圖中均清晰可見，同時(shí)非特異擴(kuò) 增被抑制。說明氧化石墨帰材料的加入有助于提高多重PCR的均衡性。
[0166] 實(shí)施例5 ;不同濃度的氧化石墨帰（GO)對(duì)Lambda DNA多重?cái)U(kuò)增的影響
[0167] 1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>[0168] W Lambda DNA為模板，對(duì)8個(gè)DNA片段在一個(gè)PCR反應(yīng)中進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增。比較未 添加氧化石墨帰W及添加不同量氧化石墨帰的多重PCR效果。
[0169] 2.實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0170] 用于擴(kuò)增的引物序列及產(chǎn)物長度

[0173] PCR溶液體系組成（25 y L):
[0174]
[017引 PCR步驟和條件；（I) 95°c預(yù)變性5分鐘；似95°C預(yù)變性I分鐘，6(TC退火I分鐘， 72C延伸1分鐘30砂；重復(fù)40個(gè)循環(huán)；（3) 68C延伸10分鐘；
[0176] 電泳分析條件：同實(shí)施例1。
[0177] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0178] 對(duì)多重PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。M表示 DNA marker, N表示不加模板、不加氧化石墨帰的陰性對(duì)照，C表示不加氧化石墨帰、加入模 板的陽性對(duì)照。泳道1-9分別表示加入氧化石墨帰50、100、150、200、250、300、350、400和 450ng的多重PCR結(jié)果。圖中從下向上產(chǎn)物長度依次為；ICUbp、162bp、202bp、323bp、524bp、 630bp、754bp和1046bp。從圖5可見，在不添加氧化石墨帰的情況下，只有少數(shù)特異的目標(biāo) 條帶可W被檢測(cè)到，同時(shí)存在其它非特異條帶；隨著氧化石墨帰的加入，多重PCR的特異性 逐漸增強(qiáng)，且非特異產(chǎn)物被逐漸抑制，最終在加入250-3(K)ng的氧化石墨帰時(shí)達(dá)到最佳結(jié) 果。得到8條單一明亮的特異條帶。
[0179] 實(shí)施例6 ;氧化石墨帰對(duì)含有錯(cuò)配的引物的擴(kuò)增優(yōu)化
[0180] 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模豪煤绣e(cuò)配堿基的引物進(jìn)行PCR，利用氧化石墨帰提高PCR的特異 性，說明氧化石墨帰對(duì)PCR特異性的增強(qiáng)作用。
[0181] 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
[0182] 引物序列；正向引物分別含有0、1個(gè)錯(cuò)配，反向引物無錯(cuò)配
[0184] 實(shí)驗(yàn)材料
[0185] PCR溶液體系組成（25 ii L):
[018引 PCR步驟和條件；（1)95°C預(yù)變性5分鐘；似95°C預(yù)變性30砂，55 °C退火30砂， 72 °C延伸30砂；重復(fù)40個(gè)循環(huán)；（3) 72 °C延伸5分鐘；
[0189] 圖6A為不含錯(cuò)配的引物的擴(kuò)增結(jié)果，圖6B為正向引物中含有一個(gè)錯(cuò)配堿基（紅 色G)的擴(kuò)增結(jié)果。每組1-4分別表示加入0、50、100、150ng氧化石墨帰（GO)。對(duì)于與模板 完全互補(bǔ)的引物的情況（圖6A)，可W擴(kuò)增出單一明亮的336bp條帶；對(duì)于正向引物含有一 個(gè)錯(cuò)配的情況下（圖6B)，在擴(kuò)增產(chǎn)物中有明顯的非特異條帶（化b-2化處），隨著氧化石墨 帰濃度的增加，非特異產(chǎn)物逐漸被抑制，當(dāng)加入100-15化g的氧化石墨帰后，非特異產(chǎn)物被 完全抑制，同時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物（336bp)的擴(kuò)增不受影響。
[0190] 實(shí)施例7 ;氧化石墨帰對(duì)短引物的擴(kuò)增的優(yōu)化
[01川實(shí)驗(yàn)?zāi)康模挥糜赑CR的引物長度通常為18-25個(gè)堿基。理論上，引物的堿基數(shù)越 少，引物與模板DNA之間發(fā)生非特異配對(duì)的幾率越高，PCR的特異性越差。當(dāng)待擴(kuò)增模板較 復(fù)雜時(shí)（如人類基因組DNA)，送種錯(cuò)配導(dǎo)致的非特異擴(kuò)增更加明顯。根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 W文獻(xiàn)報(bào)道，氧化石墨帰（GO)和還原的氧化石墨帰（RGO)可W提高PCR的特異性，但使用 短引物（15個(gè)堿基）的進(jìn)行擴(kuò)增依然是個(gè)難題。本實(shí)驗(yàn)的思路是，利用較短的引物（15個(gè) 堿基）進(jìn)行單重PCR，并利用氧化石墨帰增強(qiáng)送種PCR的特異性，W說明氧化石墨帰能抑制 非特異擴(kuò)增，增強(qiáng)特異性擴(kuò)增和產(chǎn)量。
[0192] 實(shí)驗(yàn)材料和方法：
[0193] 引物序列：
[0194]
[0196] PCR步驟和條件；（I) 95°C預(yù)變性5分鐘；似95°C預(yù)變性30砂，30~55°C退火30 砂，72 C延伸30砂；重復(fù)40個(gè)循環(huán)；（3) 72 C延伸5分鐘；
[0197] PCR步驟和條件；（1)95°C預(yù)變性5分鐘；似95°C預(yù)變性30砂，5(TC退火30砂， 72 °C延伸30砂；重復(fù)40個(gè)循環(huán)；（3) 72 °C延伸5分鐘；
[019引 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0199] 從圖7中AU BUCl可W看出，在不加入氧化石墨帰的條件下，使用短引物（15個(gè) 堿基）的PCR在各退火溫度下的擴(kuò)增結(jié)果中均出現(xiàn)多個(gè)非特異條帶，而特異性條帶幾乎不 可見。送是因?yàn)橐锟s短會(huì)導(dǎo)致引物與模板DNA發(fā)生非特異配對(duì)的幾率增大，產(chǎn)生多個(gè)非 目標(biāo)產(chǎn)物，導(dǎo)致PCR表現(xiàn)出極低的特異性。此外，圖AUBUCl表明，僅通過調(diào)節(jié)退火溫度均 不能有效提高PCR的特異性。為說明氧化石墨帰對(duì)PCR的特異性有顯著增強(qiáng)的作用，我們 選擇在退火溫度為5(TC條件下進(jìn)行氧化石墨帰優(yōu)化的PCR實(shí)驗(yàn)（圖A2、B2、C2)。從圖中可 W看出氧化石墨帰濃度的增加對(duì)PCR特異性增強(qiáng)的明顯趨勢(shì)；隨著PCR反應(yīng)中氧化石墨帰 濃度的增加，非特異產(chǎn)物被逐漸抑制，同時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物亮度逐漸增強(qiáng)（圖中白色箭頭所示）。 送說明氧化石墨帰可W有效抑制引物與模板DNA之間的非特異配對(duì)、抑制非特異擴(kuò)增，同 時(shí)增強(qiáng)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量。
[0200] 實(shí)施例8 ;氧化石墨帰優(yōu)化的多重PCR產(chǎn)物測(cè)序
[0201] 1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>[020引利用氧化石墨帰優(yōu)化多重PCR，并將多重PCR的產(chǎn)物分別回收并測(cè)序，W檢驗(yàn)被擴(kuò) 增的條帶為目標(biāo)產(chǎn)物。
[0203] 2.實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0204] 多重PCR實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例1 ;
[020引 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Ki t Ver. 4. 0
[0206] TaKaRa ExTaq HotStart DNA 聚合酶
[0207] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[020引將氧化石墨帰作為優(yōu)化劑添加到多重PCR體系中，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳下 分別切膠回收。切膠回收后的產(chǎn)物分別用其特異性的引物對(duì)進(jìn)行二次擴(kuò)增。二次擴(kuò)增產(chǎn)物 在2%的瓊脂糖凝膠電泳下檢測(cè)（圖8)。
[0209] 圖8.切膠回收產(chǎn)物的二次擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖。從圖8中可W看到，W切膠回收的各 產(chǎn)物為模板，使用特異的引物對(duì)都能擴(kuò)增出單一的條帶，送些條帶的位置與W人類基因組 DNA為模板的陽性對(duì)照產(chǎn)物的位置抑制，說明二次擴(kuò)增都得到了目標(biāo)產(chǎn)物。此外，各組陰性 對(duì)照中都沒有觀察到污染條帶，說明由二次擴(kuò)增的產(chǎn)物來自于對(duì)回收產(chǎn)物的擴(kuò)增。
[0210] 表 1
[0212] 從表1中可W進(jìn)一步證明，將多重PCR產(chǎn)物分別切膠回收并二次擴(kuò)增后的PCR產(chǎn) 物的序列與目標(biāo)區(qū)域的序列一致。說明利用氧化石墨帰優(yōu)化的多重PCR得到的產(chǎn)物均為目 標(biāo)產(chǎn)物。
[0213] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考郝樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，送些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于，包括步驟： (A) 提供一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，所述反應(yīng)體系含有待擴(kuò)增的模板、用于擴(kuò)增的引物 對(duì)、聚合酶、氧化石墨烯和用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需的試劑； (B) 對(duì)上一步驟的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而獲得含擴(kuò)增產(chǎn)物的 反應(yīng)混合物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物包括分別對(duì)應(yīng)于所述引物對(duì)的各擴(kuò)增產(chǎn)物；和 (C) 任選地，對(duì)上一步驟中的反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳和/或測(cè)序檢測(cè)， 其中，所述的用于擴(kuò)增的引物對(duì)包括3-30個(gè)引物對(duì)。2. 如權(quán)利要求1所述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于，在適量氧化石墨烯存 在下，所述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中以同樣的退火溫度或氧化石墨烯濃度在低拷貝模板的 條件下能擴(kuò)增出全部特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。3. 如權(quán)利要求1所述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于，用于擴(kuò)增的引物對(duì)包 括3-15個(gè)引物對(duì)，較佳地5-10對(duì)，更佳地6-9個(gè)引物對(duì)。4. 如權(quán)利要求1所述的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于，在所述反應(yīng)體系中，待 擴(kuò)增的模板的總量為〇. 5-100ng，較佳地l-50ng。5. -種用于多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含： 一容器A以及位于所述容器內(nèi)的用于在多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行特異性擴(kuò)增多種靶 序列的3-20引物對(duì)；以及 一容器B以及位于所述容器內(nèi)的氧化石墨烯；和 使用說明書。6. -種氧化石墨烯的用途，其特征在于，用于制備或用作提高多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的 靈敏度和特異性的增強(qiáng)劑。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。該方法包括步驟：(A)提供一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，所述反應(yīng)體系含有待擴(kuò)增的模板、用于擴(kuò)增的引物對(duì)、聚合酶、氧化石墨烯和用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需的試劑；(B)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而獲得含擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)混合物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物包括分別對(duì)應(yīng)于所述引物對(duì)的各擴(kuò)增產(chǎn)物；和(C)對(duì)上一步驟中的反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳和/或測(cè)序檢測(cè)。本發(fā)明方法可在含低拷貝量復(fù)雜模板的、極易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的多重PCR反應(yīng)體系中，非常高效而準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出全部特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明方法可廣泛用于各種不同的檢測(cè)領(lǐng)域。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105603055
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410664724
【發(fā)明人】張琛, 張東華, 張益 , 胡鈞
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2014年11月19日