中的試劑包括特異性與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合的探針。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑，所述的試劑包括 探針、和/或核酸芯片。
[0046] 在本發(fā)明的第H方面，提供了一種氧化石墨帰的用途，該用途用于制備或用作提 高多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的靈敏度和特異性的增強(qiáng)劑。
[0047] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[004引圖1顯示了不同濃度的氧化石墨帰對(duì)多重PCR特異性的影響。其中，W人類基因組 為模板擴(kuò)增8個(gè)癌癥基因，M表示DNA marker, N表示不加模板、不加氧化石墨帰的陰性對(duì) 照，C表示不加氧化石墨帰、加入模板的陽性對(duì)照。泳道1-9分別表示加入氧化石墨帰30、 60、90、120、150、180、210、240 和 270ng的多重PCR結(jié)果。圖中從下向上產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為： 52bp、74bp、90bp、131bp、152bp、176bp、336bp 和 552bp。
[0049] 圖2顯示了氧化石墨帰對(duì)多重PCR靈敏度的影響。其中，W人類基因組為模板同 時(shí)對(duì)8個(gè)癌癥基因進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增；M表示DNA marker,Nl表示不加模板、不加氧化石墨帰的 陰性對(duì)照；A組表示不加氧化石墨帰的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果，其中A1-A4分別表示加入模板175ng、 25ng、5ng和Ing的擴(kuò)增結(jié)果；N2表示加入氧化石墨帰、不加模板的陰性對(duì)照；B組表示加人 250ng的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果，其中B1-B4分別表示加入模板175ng、25ng、5ng和Ing的擴(kuò)增結(jié)果。 圖中從下向上產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為；5化口、746口、9化口、13化口、15化口、17化口、3366口和55化口。
[0050] 圖3分別顯示了不加和加入了適量氧化石墨帰后，在不同退火溫度下的多重PCR 結(jié)果。其中M表示DNA marker值L 2000)，A組表示不加氧化石墨帰的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果，B組 表示加氧化石墨帰巧化g)的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果。Nl表示不加模板、不加氧化石墨帰的陰性 對(duì)照；其中A1-A6表示不加入GO情況下在不同退火溫度下的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果；N2表示加入 GO巧化g)但不加模板的陰性對(duì)照；B1-B6組表示加入50ng氧化石墨帰時(shí)在不同退火溫度 下的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果。圖中從下向上產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為；l(Hbp、202bp、323bp、524bp、630bp、 754bp、1045bp 和 1674bp。
[0051] 圖4顯示了氧化石墨帰對(duì)多重PCR均一性的提高效果。其中，W人類基因組DM為 模板DNA。其中，M表示DNA marker, A組表示不加氧化石墨帰的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果，B組表示加 氧化石墨帰巧化g)的多重?cái)U(kuò)增結(jié)果。Nl表示不加模板、不加氧化石墨帰的陰性對(duì)照；其中 A1、A2表示不加入GO的3重?cái)U(kuò)增結(jié)果；N2表示加入GO巧化g)但不加模板的陰性對(duì)照；B1、 B2組表示加入50ng氧化石墨帰的3重?cái)U(kuò)增結(jié)果。圖中從下向上產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為；176bp、 203bp 和 258bp。
[0052] 圖5顯示了不同濃度的氧化石墨帰對(duì)Lambda DNA多重?cái)U(kuò)增的影響；對(duì)多重PCR后 的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。M表示DNA marker,N表示不加模 板、不加氧化石墨帰的陰性對(duì)照，C表示不加氧化石墨帰、加入模板的陽性對(duì)照。泳道1-9分 別表示加入氧化石墨帰50、100、150、200、250、300、350、400和450叫的多重？0?結(jié)果。圖 中從下向上產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為；10化口、1626口、2026口、3236口、5246口、6306口、7546口和 10456口。
[0053] 圖6顯示了不同濃度的氧化石墨帰對(duì)含有錯(cuò)配的引物的擴(kuò)增優(yōu)化。圖6A為不含 錯(cuò)配的引物的擴(kuò)增結(jié)果，圖6B為正向引物中含有一個(gè)錯(cuò)配堿基（紅色G)的擴(kuò)增結(jié)果。M表 示DNA marker, Nl和N2表示不加模板、不加氧化石墨帰的陰性對(duì)照。每組1-4分別表示加 入 0、50、100、150ng 氧化石墨帰（GO)。
[0054] 圖7顯示了短引物（15個(gè)堿基）的單重PCR結(jié)果W及不同濃度的氧化石墨帰對(duì) 短引物單重PCR的擴(kuò)增優(yōu)化效果。其中，A、B、C組分別表示使用15個(gè)堿基的引物對(duì)基因 TS皿、PDGFRA和EGFR的擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為；mbp、132bp和15化P。其中圖 八1、81、(：1表示無氧化石墨帰優(yōu)化的？0?在不同退火溫度（30、35、40、45、50、55°〇的擴(kuò)增 結(jié)果。圖A2、B2、C2分別表示在不同氧化石墨帰濃度下PCR的擴(kuò)增結(jié)果，圖下方的數(shù)字表示 每個(gè)PCR反應(yīng)對(duì)應(yīng)的氧化石墨帰用量。
[00巧]圖8顯示了切膠回收產(chǎn)物的二次擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果。圖8A-圖細(xì)分別表示產(chǎn)物 為552、336、176、152、131、90、74、52bp(分別編為樣品1至樣品8)的二次擴(kuò)增電泳結(jié)果。 每組中N表示不加 DNA模板的陰性對(duì)照；P1-P8表示各組的陽性對(duì)照，模板為人類基因組 (25ng) ;A-H組中1、2泳道（如A1、A2)分別表示各組二次擴(kuò)增的結(jié)果。表1顯示了各產(chǎn)物 對(duì)應(yīng)基因名稱、待擴(kuò)增基因所在的染色體編號(hào)和擴(kuò)增產(chǎn)物的理論長(zhǎng)度；實(shí)際測(cè)序的一致區(qū) 域和測(cè)序產(chǎn)物長(zhǎng)度。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，通過對(duì)試驗(yàn)條件的大量篩選，首次開發(fā)了一種 優(yōu)化的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。通過本發(fā)明方法，可在含低拷貝量復(fù)雜模板（如1或5ng 人類基因組模板）的、極其產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的多重PCR反應(yīng)體系（如8個(gè)或更多個(gè)引物 對(duì)）中，非常高效而準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出全部特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0057] 術(shù)語
[0058] 在本發(fā)明中，術(shù)語"多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（多重PCR)"指在一個(gè)PCR反應(yīng)中，使用 多對(duì)特異性引物對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增。在本發(fā)明中，所述的多重通常指3-20重，較佳 地3-15重，更佳地5-10重。
[0059] 氧化石墨帰
[0060] 在本發(fā)明中，所述的多重PCR反應(yīng)體系中含有一定量的氧化石墨帰。
[0061] 在本發(fā)明中，適用的氧化石墨帰沒有特別限制，可W采用市售的或用常規(guī)方法制 備的氧化石墨帰。通常，可將石墨用強(qiáng)酸氧化而制得氧化石墨帰。
[0062] 通常，氧化石墨帰的表面具有駿基、居基、和/或氨基等基團(tuán)。此外，氧化石墨帰還 可含有其他任選的官能團(tuán)，例如撰基等?？捎糜诒景l(fā)明的氧化石墨帰沒有特別限制，通常包 括（但并不限于）；利用改進(jìn)的Hummer法制備的水溶性氧化石墨帰。一類優(yōu)選的氧化石墨 帰是表面含有駿基或居基基團(tuán)的氧化石墨帰。
[0063] 本發(fā)明的試驗(yàn)表明，對(duì)于低模板量的高復(fù)雜度的多重PCR反應(yīng)體系，氧化石墨帰 可顯著提高PCR的特異性、靈敏度和擴(kuò)增產(chǎn)量，并可消除擴(kuò)增中形成的引物二聚體。
[0064] 在本發(fā)明的多重PCR反應(yīng)體系中，氧化石墨帰的用量通常為為100 - 5(K)ng/25微 升；較佳地150 - 40化g/25微升；較佳地200 - 30化g/25微升。
[00財(cái) 多重引物對(duì)
[0066] 在本發(fā)明中，所使用的多重引物對(duì)包括3個(gè)或更多個(gè)引物對(duì)。
[0067] 在本發(fā)明中，用于擴(kuò)增的多重引物對(duì)可包括3-50個(gè)引物對(duì)或3-30個(gè)引物對(duì)。通 常，本發(fā)明多重PCR反應(yīng)體系中含有3-15個(gè)引物對(duì)，較佳地5-10對(duì)，更佳地6-9個(gè)引物對(duì)。
[0068] 在另一優(yōu)選例中，所述的用于擴(kuò)增的引物對(duì)中至少一個(gè)或多個(gè)或全部引物（優(yōu)選 全部引物）的長(zhǎng)度為15-2化P，較佳地15-20bp，更佳地為15-18bp，最佳地為15-1化口。
[0069] 在另一優(yōu)選例中，所述的用于擴(kuò)增的引物對(duì)包括多個(gè)引物對(duì)，且所有引物中各引 物的Tm的最大值Tmax與各引物的Tm的最小值Tmin之間差值A(chǔ) =〇-5°C，較佳地A = 0-rc。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述的引物對(duì)中，至少有2個(gè)引物對(duì)共用同一引物（作為通用的 上游引物或下游引物），并且所述至少2個(gè)引物對(duì)的另一側(cè)引物僅相差1 - 2個(gè)堿基。
[0071] 在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)中只含有一個(gè)錯(cuò)配堿基。如本文所用，所述"引物對(duì) 中只含有一個(gè)錯(cuò)配堿基"指第一引物對(duì)與第二引物對(duì)的序列除了一個(gè)引物相差1個(gè)堿基之 夕F，完全相同。較佳地，所述的錯(cuò)配堿基位于3'端或位于引物的中間區(qū)域。
[007引多重PCR反應(yīng)體系
[0073] 在本發(fā)明中，多重PCR反應(yīng)體系含有待擴(kuò)增的模板、用于擴(kuò)增的引物對(duì)、聚合酶、 氧化石墨帰和用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需的試劑。
[0074] 通常，所述的待擴(kuò)增的模板是來源于各種不同生物體（包括病原體、細(xì)菌、哺乳動(dòng) 物如人）的總核酸提取物，例如基因組模板。
[00巧]典型地，在多重PCR反應(yīng)體系中，模板的濃度通常為0. 1-1化g/微升，較佳地為 0. 5-5ng/微升，更佳地為0. 8-化g/微升（如約Ing/微升）。
[0076] 在本發(fā)明的多重PCR反應(yīng)體系中，所述引物對(duì)中各引物濃度沒有特別限制。典 型地，各引物的終濃度為0. 05-0. 5 U M，較佳地為0. 1-0. 4 U M，更佳地為0. 1-0. 3 U M(約 0. 2 U M)。
[0077] 應(yīng)理解，在本發(fā)明多重PCR反應(yīng)體系中，可含有其他有助于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 其他試劑或成分，例如包括（但并不限于）一種或多種選自下組的試劑：
[0078] (i) PCR緩沖液（含鎮(zhèn)離子等）
[0079] (ii)dNTP
[0080] (iii)ddH2〇〇
[0081] 在本發(fā)明中，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系的總體積沒有特別限制，通常可W為 10-200微升，較佳地20-100微升，更佳地25-50微升。
[0082] 擴(kuò)增方法及擴(kuò)增產(chǎn)物
[0083] 采用本發(fā)明的多重PCR反應(yīng)體系，可在常規(guī)的PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。
[0084] 典型地，該擴(kuò)增方法包括變性、退火和延伸步驟，并且包括20-50個(gè)循環(huán)。
[0085] 在另一優(yōu)選例中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度為Tfg ±5°C，較佳地為Tf ±3°C， 其中為所有引物的Tm的算術(shù)平均值。
[0086] 在另一優(yōu)選例中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度為45-7(TC，較佳地為約50°C。
[0087] 在本發(fā)明中，由于采用了特別優(yōu)化的反應(yīng)條件，因此，即使采用高達(dá)8個(gè)或更多個(gè) 引物對(duì)，仍可高效準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出全部所需的擴(kuò)增產(chǎn)物，且可有效抑制了引物二聚體和其它 非特異性產(chǎn)物的形成。
[0088] 在本發(fā)明中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括分別對(duì)應(yīng)于所述引物對(duì)的n種擴(kuò)增產(chǎn)物。通常， 在本發(fā)明的反應(yīng)混合物中，所述n擴(kuò)增產(chǎn)物中擴(kuò)增量最大的擴(kuò)增產(chǎn)物A與所