馬鈴薯抗低溫糖化分子標(biāo)記組合及其在馬鈴薯抗低溫糖化育種中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)與遺傳育種領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及馬鈴馨抗低溫糖化分子 標(biāo)記組合及其在馬鈴馨抗低溫糖化育種中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴馨是（Solanum tuberrosum L.)世界第四大糧食作物，馬鈴馨加工在馬鈴馨 產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，其中馨片馨條等馬鈴馨油炸加工產(chǎn)品因其食用方便和風(fēng)味獨特備受 青睞，所占份額最大。但油炸加工對馬鈴馨塊莖品質(zhì)的要求較高，除要求具有馨塊大、芽眼 淺、馨肉白色等外觀品質(zhì)，更重要的是干物質(zhì)含量需在20% W上，而且還原糖含量必須要低 于0.4% (鮮重）。如果塊莖中積累的還原糖含量過高，在加工時產(chǎn)生Millard反應(yīng)，致使馨片 或馨條表面顏色變褐，有的甚至糊化，口感變苦，也會生成有潛在神經(jīng)毒性和致癌性的丙締 酷胺，嚴(yán)重影響產(chǎn)品加工品質(zhì)。
[0003] 而在馬鈴馨加工產(chǎn)業(yè)中，為延長加工時間，減少因膽藏期間塊莖失水皺縮、腐爛、 發(fā)芽等造成的原料損失，消除為抑制病蟲害施用化學(xué)藥劑而帶來的健康問題和環(huán)境危害， 通常采用低溫(<l〇°C)的條件來膽藏收獲后的馬鈴馨塊莖。但低溫膽藏會加速淀粉向還原 糖的轉(zhuǎn)化，造成還原糖含量的積累，但是運導(dǎo)致了馬鈴馨塊莖中還原糖的積累，即所謂的低 溫糖化，運正是絕大多是品種不適合加工的主要原因。
[0004] 低溫糖化是一個復(fù)雜的生理學(xué)和生物化學(xué)過程，既是植物低溫誘導(dǎo)的自然反應(yīng)， 同時又存在廣泛的遺傳變異和復(fù)雜的基因調(diào)控。已有一些研究從控制低溫糖化代謝網(wǎng)絡(luò)相 關(guān)的遺傳基礎(chǔ)入手，力求掲示其遺傳機制?；痚n等(2001)利用一個馬鈴馨雙單倍體群體(2n = 24)，構(gòu)建了第一個與馬鈴馨碳水化合物代謝相關(guān)的功能分子(moleculor-化nction)圖 譜，定位了設(shè)及69個相關(guān)基因的85個WL標(biāo)記。隨后，Men自ndz等（2002)利用2個雙單倍體群 體，針對低溫糖化性狀篩選并定位了 26個WL標(biāo)記。國內(nèi)金黎平(2002)也利用二倍體群體， 通過AFLP和SSR標(biāo)記進行了 WL定位，定位結(jié)果顯示，19個WL分別分布在3、6、8、12、13、14、 15和16號連鎖群上，解釋的表型變異幅度為5.50%-70%。在關(guān)聯(lián)分析方面，D'hoop(2002) 利用AFLP標(biāo)記與馨片或馨條的色澤進行了相關(guān)分析，結(jié)果顯示，經(jīng)過4°C膽藏后塊莖炸片色 澤相關(guān)標(biāo)記位于馬鈴馨的1、6、7、8、9和12號染色體上，經(jīng)過8°C膽藏后塊莖炸片色澤相關(guān)標(biāo) 記位于馬鈴馨的1、2、4、5、6、9和10號染色體上，其中8°C和4°C膽藏后炸片色澤只有一個位 點相重疊。所有運些研究都顯示，馬鈴馨塊莖的低溫糖化是一個能穩(wěn)定遺傳性狀，存在利用 分子標(biāo)記輔助選擇的可能;但由于受多個遺傳位點控制，因此，通過類似與質(zhì)量性狀的單個 分子標(biāo)記很難達到理想的效果;再加上，馬鈴馨為同源四倍體作物，運將加大了常規(guī)選擇育 種的難度。因此，解析馬鈴馨低溫糖化的抗性遺傳機制，開發(fā)一組抗低溫糖化關(guān)聯(lián)的分子標(biāo) 記組合，對多個控制低溫糖化的WL進行檢測，形成一個抗低溫糖化品系高效準(zhǔn)確篩選方 法，將為馬鈴馨加工品種選育提供重要的技術(shù)支撐。
[0005] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一組馬鈴馨抗低溫糖化基因型篩選的分子標(biāo)記組合，所述 的分子標(biāo)記組合對馬鈴馨抗低溫糖化基因型的選育具有較高的準(zhǔn)確性，為馬鈴馨抗低溫糖 化材料的鑒定提供了基礎(chǔ)，并建立用于抗低溫糖化育種分子標(biāo)記輔助選擇體系。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用W下技術(shù)方案：
[000引馬鈴馨低溫糖化抗性的分子標(biāo)記組合，所述分子標(biāo)記為S3001-S3004核酸序列中 的任一種或多種；
[0009] S3001分子標(biāo)記的上下游引物核酸序列如沈Q ID No.l和沈Q ID齡.2所示，53002 分子標(biāo)記的上下游引物核酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，S3003分子標(biāo)記的上 下游引物核酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，S3004分子標(biāo)記的上下游引物核酸 序列如沈Q ID No.7和沈Q ID No.8所示。
[0010] 其中，S3001和S3003分子標(biāo)記位于馬鈴馨6號染色體，S3002分子標(biāo)記位于馬鈴馨5 號染色體，S3004分子標(biāo)記位于馬鈴馨7號染色體。
[0011] 本發(fā)明提供的馬鈴馨抗低溫糖化分子標(biāo)記組合，運些分子標(biāo)記通過對不同抗低溫 糖化能力的品種（系），進行相關(guān)分子標(biāo)記多態(tài)性分析和低溫還原糖含量測定，并分析標(biāo)記 和低溫糖化抗性之間的相關(guān)性，篩選得到用于建立抗低溫糖化育種分子標(biāo)記輔助選擇體系 的分子標(biāo)記組合，該分子標(biāo)記組合對抗低溫糖化馬鈴馨基因型篩選具有較高的準(zhǔn)確性，為 馬鈴馨低溫糖化抗性株系鑒定和抗低溫糖化育種提供了技術(shù)支持。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述的馬鈴馨抗低溫糖化性分子標(biāo)記獲得的方法，包括W下步 驟：
[0013] (a)、W母本邸25和父本CW2-1W及兩者雜交產(chǎn)生的后代作為材料；
[0014] (b)、提取材料的基因組DNA;
[0015] (C)、利用SSR分子標(biāo)記、AFLP分子標(biāo)記W及根據(jù)基因組序列設(shè)計的分子標(biāo)記，得到 在親本之間具有多態(tài)性的引物，用于連鎖圖譜構(gòu)建；
[0016] (d)、利用多態(tài)性引物對步驟(b)提取的兩者雜交產(chǎn)生后代的基因組DNA進行擴增， 結(jié)合低溫下塊莖還原糖含量測定測定結(jié)果，并進行互作分析，獲得馬鈴馨抗低溫糖化的 QTL，計算OTL間的加性與上位性效應(yīng)，得到所述的馬鈴馨抗低溫糖化分子標(biāo)記組合。
[0017] 本發(fā)明提供的馬鈴馨抗低溫糖化分子標(biāo)記的篩選方法，W母本抓25和父本CW2-1 W及兩者雜交產(chǎn)生的后代作為材料，WSSR分子標(biāo)記、AFLP分子標(biāo)記W及根據(jù)基因組序列設(shè) 定的分子標(biāo)記篩選馬鈴馨低溫糖化抗性的分子標(biāo)記，進行候選基因多態(tài)性分析，同時對低 溫糖化抗性進行鑒定，進行候選基因標(biāo)記和低溫糖化抗性之間的相關(guān)性分析，篩選得到用 于建立加工品質(zhì)育種分子標(biāo)記輔助選擇體系的分子標(biāo)記組合，為馬鈴馨低溫糖化抗性育種 W及馬鈴馨的加工提供技術(shù)基礎(chǔ)。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種馬鈴馨低溫糖化抗性的檢測方法，是W上述的引物對馬鈴馨 樣本的基因組提取物進行降落PCR擴增，分別對應(yīng)得到S3001的PCR擴增產(chǎn)物、S3002的PCR擴 增產(chǎn)物、S3003的PCR擴增產(chǎn)物、S3004的PCR擴增產(chǎn)物；
[0019] S3001的PCR擴增產(chǎn)物和S3002的PCR擴增產(chǎn)物直接進行檢測，S3003的PCR擴增產(chǎn)物 先采用Alu I酶酶切，酶切產(chǎn)物再進行檢測，S3004的PCR擴增產(chǎn)物先采用Afa I酶酶切，酶切 產(chǎn)物然后進行檢測；
[0020] 各分子標(biāo)記采用的降落PCR擴增程序依次為:95°C預(yù)變性3min;94°C變性30s，58°C 退火30s，72°C延伸Imin，循環(huán)11次，每次循環(huán)退火溫度降0.5°C;94°C變性30s，52°C退火 30s，72°C 延伸 60s，循環(huán) 33 次;72°C 延伸 5min;4-10°C 保存。
[0021] 本發(fā)明提供的一種檢測馬鈴馨低溫糖化抗性的方法，該方法選用上述分子標(biāo)記對 待測樣品的基因組進行降落PCR擴增，經(jīng)多次試驗驗證，采用上述降落PCR體系W及程序，擴 增特異性強，無明顯雜帶出現(xiàn)，得到的擴增片段易于檢測。由于分子標(biāo)記為S3003和S3004 時，兩者PCR擴增得到的產(chǎn)物沒有多態(tài)性，因此，酶切后才能觀察到其多態(tài)性，W實現(xiàn)鑒定的 目的。最終通過觀察PCR擴增產(chǎn)物或PCR擴增產(chǎn)物酶切片段的多態(tài)性檢測來判斷馬鈴馨的低 溫糖化抗性，方便易行，為馬鈴馨低溫糖化分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支持。
[0022] 為了得到的PCR擴增產(chǎn)物節(jié)約成本，易于觀察，且不產(chǎn)生其他干擾條帶，進一步地， 各分子標(biāo)記的降落PCR體系均為15-2扣1;馬鈴馨樣本的基因組提取物在降落PCR體系中的 添加量為50ngW上；更優(yōu)選的馬鈴馨樣本的基因組提取物在降落PCR體系中的添加量為 100-200ng。
[0023] 經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，由S3001分子標(biāo)記、S3002分子標(biāo)記、S3003分子標(biāo)記和S3004分子標(biāo)記 組成的標(biāo)記組合具有更好的低溫糖化抗性，優(yōu)選地，檢測馬鈴馨低溫糖化抗性采用的分子 標(biāo)記組合為S3001分子標(biāo)記、S3002分子標(biāo)記、S3003分子標(biāo)記和S3004分子標(biāo)記。
[0024] 進一步地，檢測抗低溫糖化馬鈴馨基因型表現(xiàn)為S3001無目標(biāo)帶，S3002分子標(biāo)記、 S3003分子標(biāo)記和S3004分子標(biāo)記均有目標(biāo)條帶。
[0025] 優(yōu)選地，所述